③比表面积。在液固吸附色谱法中，硅胶的比表面积越大，溶质的k值越大。
④含碳量及表面覆盖度（率）。在反相色谱法中，含碳量越大，溶质的k值越大。
⑤含水量及表面活性。在液固吸附色谱法中，硅胶的含水量越小，其表面硅醇基的活性越强，对溶质的吸附作用越大。
⑥端基封尾。在反相色谱法中，主要影响碱性化合物的峰形。
⑦几何形状。硅胶可分为无定形全多孔硅胶和球形全多孔硅胶，前者价格较便宜，缺点是涡流扩散项及柱渗透性差；后者无此缺点。
⑧硅胶纯度。对称柱填料使用高纯度硅胶，柱效高，寿命长，碱性成份不拖尾。
2）氧化铝
具有与硅胶相同的良好物理性质，也能耐较大的pH范围。它也是刚性的，不会在溶剂中收缩或膨胀。但与硅胶不同的是，氧化铝键合相在水性流动相中不稳定。不过现在已经出现了在水相中稳定的氧化铝键合相，并显示出优秀的pH稳定性。
3）聚合物
以高交联度的苯乙烯-二乙烯苯或聚甲基丙烯酸酯为基质的填料是用于普通压力下的HPLC，它们的压力限度比无机填料低。苯乙烯-二乙烯苯基质疏水性强。使用任何流动相，在整个pH范围内稳定，可以用NaOH或强碱来清洗色谱柱。甲基丙烯酸酯基质本质上比苯乙烯-二乙烯苯疏水性更强，但它可以通过适当的功能基修饰变成亲水性的。这种基质不如苯乙烯-二乙烯苯那样耐酸碱，但也可以承受在pH13下反复冲洗。
所有聚合物基质在流动相发生变化时都会出现膨胀或收缩。用于HPLC的高交联度聚合物填料，其膨胀和收缩要有限制。溶剂或小分子容易渗入聚合物基质中，因为小分子在聚合物基质中的传质比在陶瓷性基质中慢，所以造成小分子在这种基质中柱效低。对于大分子像蛋白质或合成的高聚物，聚合物基质的效能比得上陶瓷性基质。因此，聚合物基质广泛用于分离大分子物质。
2．基质的选择
硅胶基质的填料被用于大部分的HPLC分析，尤其是小分子量的被分析物，聚合物填料用于大分子量的被分析物质，主要用来制成分子排阻和离子交换柱。
硅胶
氧化铝
苯乙烯-二乙烯苯
甲基丙烯酸酯
耐有机溶剂
+++
+++
++
++
适用pH范围
+
++
+++
++
抗膨胀/收缩
+++
+++
+
+
耐压
+++
+++
++
+
表面化学性质
+++
+
++
+++
效能
+++
++
+
+
注：+++好 ++一般 +差
二、化学键合固定相
将有机官能团通过化学反应共价键合到硅胶表面的游离羟基上而形成的固定相称为化学键合相。这类固定相的突出特点是耐溶剂冲洗，并且可以通过改变键合相有机官能团的类型来改变分离的选择性。
1．键合相的性质
目前，化学键合相广泛采用微粒多孔硅胶为基体，用烷烃二甲基氯硅烷或烷氧基硅烷与硅胶表面的游离硅醇基反应，形成Si-O-Si-C键形的单分子膜而制得。硅胶表面的硅醇基密度约为5个/nm2，由于空间位阻效应（不可能将较大的有机官能团键合到全部硅醇基上）和其它因素的影响，使得大约有40~50%的硅醇基未反应。
残余的硅醇基对键合相的性能有很大影响，特别是对非极性键合相，它可以减小键合相表面的疏水性，对极性溶质（特别是碱性化合物）产生次级化学吸附，从而使保留机制复杂化（使溶质在两相间的平衡速度减慢，降低了键合相填料的稳定性。结果使碱性组分的峰形拖尾）。为尽量减少残余硅醇基，一般在键合反应后，要用三甲基氯硅烷(TMCS)等进行钝化处理，称封端（或称封尾、封顶，end-capping），以提高键合相的稳定性。另一方面，也有些ODS填料是不封尾的，以使其与水系流动相有更好的“湿润”性能。
由于不同生产厂家所用的硅胶、硅烷化试剂和反应条件不同，因此具有相同键合基团的键合相，其表面有机官能团的键合量往往差别很大，使其产品性能有很大的不同。键合相的键合量常用含碳量(C%)来表示，也可以用覆盖度来表示。所谓覆盖度是指参与反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数的比例。
pH值对以硅胶为基质的键合相的稳定性有很大的影响，一般来说，硅胶键合相应在pH=2~8的介质中使用。
2．键合相的种类
化学键合相按键合官能团的极性分为极性和非极性键合相两种。
常用的极性键合相主要有氰基(-CN)、氨基(-NH2)和二醇基(DIOL)键合相。极性键合相常用作正相色谱，混合物在极性键合相上的分离主要是基于极性键合基团与溶质分子间的氢键作用，极性强的组分保留值较大。极性键合相有时也可作反相色谱的固定相。
常用的非极性键合相主要有各种烷基(C1~C18)和苯基、苯甲基等，以C18应用最广。非极性键合相的烷基链长对样品容量、溶质的保留值和分离选择性都有影响，一般来说，样品容量随烷基链长增加而增大，且长链烷基可使溶质的保留值增大，并常常可改善分离的选择性；但短链烷基键合相具有较高的覆盖度，分离极性化合物时可得到对称性较好的色谱峰。苯基键合相与短链烷基键合相的性质相似。
另外C18柱稳定性较高，这是由于长的烷基链保护了硅胶基质的缘故，但C18基团空间体积较大，使有效孔径变小，分离大分子化合物时柱效较低。
3．固定相的选择
分离中等极性和极性较强的化合物可选择极性键合相。氰基键合相对双键异构体或含双键数不等的环状化合物的分离有较好的选择性。氨基键合相具有较强的氢键结合能力，对某些多官能团化合物如甾体、强心甙等有较好的分离能力；氨基键合相上的氨基能与糖类分子中的羟基产生选择性相互作用，故被广泛用于糖类的分析，但它不能用于分离羰基化合物，如甾酮、还原糖等，因为它们之间会发生反应生成Schiff 碱。二醇基键合相适用于分离有机酸、甾体和蛋白质。
分离非极性和极性较弱的化合物可选择非极性键合相。利用特殊的反相色谱技术，例如反相离子抑制技术和反相离子对色谱法等，非极性键合相也可用于分离离子型或可离子化的化合物。ODS(octadecyl silane)是应用最为广泛的非极性键合相，它对各种类型的化合物都有很强的适应能力。短链烷基键合相能用于极性化合物的分离，而苯基键合相适用于分离芳香化合物。
另外，美国药典对色谱法规定较严，它规定了柱的长度，填料的种类和粒度，填料分类也较详细，这样使色谱图易于重现；而中国药典仅规定填料种类，未规定柱的长度和粒度，这使检验人员难于重现实验，在某些情况下还浪费时间和试剂。
三、流动相
1．流动相的性质要求
一个理想的液相色谱流动相溶剂应具有低粘度、与检测器兼容性好、易于得到纯品和低毒性等特征。
选好填料（固定相）后，强溶剂使溶质在填料表面的吸附减少，相应的容量因子k降低；而较弱的溶剂使溶质在填料表面吸附增加，相应的容量因子k升高。因此，k值是流动相组成的函数。塔板数N一般与流动相的粘度成反比。所以选择流动相时应考虑以下几个方面：
①流动相应不改变填料的任何性质。低交联度的离子交换树脂和排阻色谱填料有时遇到某些有机相会溶胀或收缩，从而改变色谱柱填床的性质。碱性流动相不能用于硅胶柱系统。酸性流动相不能用于氧化铝、氧化镁等吸附剂的柱系统。
②纯度。色谱柱的寿命与大量流动相通过有关，特别是当溶剂所含杂质在柱上积累时。
③必须与检测器匹配。使用UV检测器时，所用流动相在检测波长下应没有吸收，或吸收很小。当使用示差折光检测器时，应选择折光系数与样品差别较大的溶剂作流动相，以提高灵敏度。
④粘度要低（应<>）。高粘度溶剂会影响溶质的扩散、传质，降低柱效，还会使柱压降增加，使分离时间延长。最好选择沸点在100℃以下的流动相。
⑤对样品的溶解度要适宜。如果溶解度欠佳，样品会在柱头沉淀，不但影响了纯化分离，且会使柱子恶化。
⑥样品易于回收。应选用挥发性溶剂。
2．流动相的选择
在化学键合相色谱法中，溶剂的洗脱能力直接与它的极性相关。在正相色谱中，溶剂的强度随极性的增强而增加；在反相色谱中，溶剂的强度随极性的增强而减弱。
正相色谱的流动相通常采用烷烃加适量极性调整剂。
反相色谱的流动相通常以水作基础溶剂，再加入一定量的能与水互溶的极性调整剂，如甲醇、乙腈、四氢呋喃等。极性调整剂的性质及其所占比例对溶质的保留值和分离选择性有显著影响。一般情况下，甲醇-水系统已能满足多数样品的分离要求，且流动相粘度小、价格低，是反相色谱最常用的流动相。但Snyder则推荐采用乙腈-水系统做初始实验，因为与甲醇相比，乙腈的溶剂强度较高且粘度较小，并可满足在紫外185~205nm处检测的要求，因此，综合来看，乙腈-水系统要优于甲醇-水系统。
在分离含极性差别较大的多组分样品时，为了使各组分均有合适的k值并分离良好，也需采用梯度洗脱技术。
参考资料：
乙腈的毒性是甲醇的5倍，是乙醇的25倍。价格是甲醇的6~7倍。
反相色谱中，如果要在相同的时间内分离同一组样品，甲醇/水作为冲洗剂时其冲洗强度配比与乙腈/水或四氢呋喃/水的冲洗强度配比有如下关系：
C乙腈＝0.32C 2甲醇＋0.57C甲醇
C四氢呋喃＝0.66C甲醇
C为不同有机溶剂与水混合的体积百分含量。100%甲醇的冲洗强度相当于89%的乙腈/水或66%的四氢呋喃/水的冲洗强度。
3．流动相的pH值
采用反相色谱法分离弱酸（3≤pKa≤7）或弱碱（7≤pKa≤8）样品时，通过调节流动相的pH值，以抑制样品组分的解离，增加组分在固定相上的保留，并改善峰形的技术称为反相离子抑制技术。对于弱酸，流动相的pH值越小，组分的k值越大，当pH值远远小于弱酸的pKa值时，弱酸主要以分子形式存在；对弱碱，情况相反。分析弱酸样品时，通常在流动相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和1%醋酸溶液；分析弱碱样品时，通常在流动相中加入少量弱碱，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和30mmol/L三乙胺溶液。
注：流动相中加入有机胺可以减弱碱性溶质与残余硅醇基的强相互作用，减轻或消除峰拖尾现象。所以在这种情况下有机胺（如三乙胺）又称为减尾剂或除尾剂。
4．流动相的脱气
HPLC所用流动相必须预先脱气，否则容易在系统内逸出气泡，影响泵的工作。气泡还会影响柱的分离效率，影响检测器的灵敏度、基线稳定性，甚至使无法检测。（噪声增大，基线不稳，突然跳动）。此外，溶解在流动相中的氧还可能与样品、流动相甚至固定相（如烷基胺）反应。溶解气体还会引起溶剂pH的变化，对分离或分析结果带来误差。
溶解氧能与某些溶剂（如甲醇、四氢呋喃）形成有紫外吸收的络合物，此络合物会提高背景吸收（特别是在260nm以下），并导致检测灵敏度的轻微降低，但更重要的是，会在梯度淋洗时造成基线漂移或形成鬼峰（假峰）。在荧光检测中，溶解氧在一定条件下还会引起淬灭现象，特别是对芳香烃、脂肪醛、酮等。在某些情况下，荧光响应可降低达95%。在电化学检测中（特别是还原电化学法），氧的影响更大。
除去流动相中的溶解氧将大大提高UV检测器的性能，也将改善在一些荧光检测应用中的灵敏度。常用的脱气方法有：加热煮沸、抽真空、超声、吹氦等。对混合溶剂，若采用抽气或煮沸法，则需要考虑低沸点溶剂挥发造成的组成变化。超声脱气比较好，10~20分钟的超声处理对许多有机溶剂或有机溶剂/水混合液的脱气是足够了（一般500ml溶液需超声20~30min方可），此法不影响溶剂组成。超声时应注意避免溶剂瓶与超声槽底部或壁接触，以免玻璃瓶破裂，容器内液面不要高出水面太多。
离线（系统外）脱气法不能维持溶剂的脱气状态，在你停止脱气后，气体立即开始回到溶剂中。在1~4小时内，溶剂又将被环境气体所饱和。
在线（系统内）脱气法无此缺点。最常用的在线脱气法为鼓泡，即在色谱操作前和进行时，将惰性气体喷入溶剂中。严格来说，此方法不能将溶剂脱气，它只是用一种低溶解度的惰性气体（通常是氦）将空气替换出来。此外还有在线脱气机。
一般说来有机溶剂中的气体易脱除，而水溶液中的气体较顽固。在溶液中吹氦是相当有效的脱气方法，这种连续脱气法在电化学检测时经常使用。但氦气昂贵，难于普及。
5．流动相的滤过
所有溶剂使用前都必须经0.45μm（或0.22μm）滤过，以除去杂质微粒，色谱纯试剂也不例外（除非在标签上标明“已滤过”）。
用滤膜过滤时，特别要注意分清有机相（脂溶性）滤膜和水相（水溶性）滤膜。有机相滤膜一般用于过滤有机溶剂，过滤水溶液时流速低或滤不动。水相滤膜只能用于过滤水溶液，严禁用于有机溶剂，否则滤膜会被溶解！溶有滤膜的溶剂不得用于HPLC。对于混合流动相，可在混合前分别滤过，如需混合后滤过，首选有机相滤膜。现在已有混合型滤膜出售。
6．流动相的贮存
流动相一般贮存于玻璃、聚四氟乙烯或不锈钢容器内，不能贮存在塑料容器中。因许多有机溶剂如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增塑剂，导致溶剂受污染。这种被污染的溶剂如用于HPLC系统，可能造成柱效降低。贮存容器一定要盖严，防止溶剂挥发引起组成变化，也防止氧和二氧化碳溶入流动相。
磷酸盐、乙酸盐缓冲液很易长霉，应尽量新鲜配制使用，不要贮存。如确需贮存，可在冰箱内冷藏，并在3天内使用，用前应重新滤过。容器应定期清洗，特别是盛水、缓冲液和混合溶液的瓶子，以除去底部的杂质沉淀和可能生长的微生物。因甲醇有防腐作用，所以盛甲醇的瓶子无此现象。
7．卤代有机溶剂应特别注意的问题
卤代溶剂可能含有微量的酸性杂质，能与HPLC系统中的不锈钢反应。卤代溶剂与水的混合物比较容易分解，不能存放太久。卤代溶剂（如CCl4、CHCl3等）与各种醚类（如乙醚、二异丙醚、四氢呋喃等）混合后，可能会反应生成一些对不锈钢有较大腐蚀性的产物，这种混合流动相应尽量不采用，或新鲜配制。此外，卤代溶剂（如CH2Cl2）与一些反应性有机溶剂（如乙腈）混合静置时，还会产生结晶。总之，卤代溶剂最好新鲜配制使用。如果是和干燥的饱和烷烃混合，则不会产生类似问题。
8．HPLC用水
HPLC应用中要求超纯水，如检测器基线的校正和反相柱的洗脱。
进行HPLC、GC、电泳和荧光分析，或在涉及组织培养时，没有有机物污染是非常重要的。测高锰酸钾颜色保留时间的定性方法反应慢，对很低水平的有机物（对HPLC可能还是太高了）不够灵敏，特别是不能定量。总有机碳(TOC)分析仪（把有机物氧化成CO2，测游离的CO2）常用于I类（NCCLS）水中低浓度有机物的测定。
I类水标准：
NCCLS
ASTM
电阻率，MΩ·cm，25℃，最小
10.0
18.0
硅酸盐，mg/L，最大
0.05
0.003
微粒，μm滤器
0.22
0.2
微生物，CFU/ml
10
分三档
美国药典24版（2000年）要求TOC＜0.5 mg/L（用标准蔗糖溶液1.19 mg/L），电导率在室温pH 6时≤2.4 μS/cm（即≥0.42 MΩ·cm）。HPLC级水增加吸收特性：在1cm池中，用超纯水作空白，在190nm、200nm和250~400nm的吸收度分别不得过0.01、0.01和0.05。增加不挥发物，≤3ppm（中国药典纯水≤10ppm）。
V．HPLC应用
一、样品测定
1．流动相比例调整：由于我国药品标准中没有规定柱的长度及填料的粒度，因此每次新开检新品种时几乎都须调整流动相（按经验，主峰一般应调至保留时间为6~15分钟为宜）。所以建议第一次检验时请少配流动相，以免浪费。弱电解质的流动相其重现性更不容易达到，请注意充分平衡柱。
2．样品配制：①溶剂；②容器：塑料容器常含有高沸点的增塑剂，可能释放到样品液中造成污染，而且还会吸留某些药物，引起分析误差。某些药物特别是碱性药物会被玻璃容器表面吸附，影响样品中药物的定量回收，因此必要时应将玻璃容器进行硅烷化处理。
3．记录时间：第一次测定时，应先将空白溶剂、对照品溶液及供试品溶液各进一针，并尽量收集较长时间的图谱（如30分钟以上），以便确定样品中被分析组分峰的位置、分离度、理论板数及是否还有杂质峰在较长时间内才洗脱出来，确定是否会影响主峰的测定。
4．进样量：药品标准中常标明注入10ml，而目前多数HPLC系统采用定量环（10ml、20ml和50ml），因此应注意进样量是否一致。（可改变样液浓度）
5．计算：由于有些对照品标示含量的方式与样品标示量不同，有些是复合盐、有些含水量不同、有些是盐基不同或有些是采用有效部位标示，检验时请注意。
6．仪器的使用：
①流动相滤过后，注意观察有无肉眼能看到的微粒、纤维。有请重新滤过。
②柱在线时，增加流速应以0.1ml/min的增量逐步进行，一般不超过1ml/min，反之亦然。否则会使柱床下塌，叉峰。柱不线时，要加快流速也需以每次0.5ml/min的速率递增上去（或下来），勿急升（降），以免泵损坏。
③安装柱时，请注意流向，接口处不要留有空隙。
④样品液请注意滤过（注射液可不需滤过）后进样，注意样品溶剂的挥发性。
⑤测定完毕请用水冲柱1小时，甲醇30分钟。如果第二天仍使用，可用水以低流速（0.1~0.3ml/min）冲洗过夜（注意水要够量），不须冲洗甲醇。另外需要特别注意的是：对于含碳量高、封尾充分的柱，应先用含5~10%甲醇的水冲洗，再用甲醇冲洗。
⑥冲水的同时请用水充分冲洗柱头（如有自动清洗装置系统，则应更换水）。
二、方法研究
1．波长选择：首先在可见紫外分光光度计上测量样品液的吸收光谱，以选择合适的测量波长，如最灵敏的测量波长并避开其它物质的干扰。从紫外光谱中还可大体知道在HPLC中的响应值，如吸收度小于0.5时，HPLC测定的面积将会很小。
2．流动相选择：尽量采用不是弱电解质的甲醇-水流动相。
附件：高效液相色谱法（HPLC）复核细则
一、对起草单位的要求：
1．HPLC法用于药品的有关物质检查或含量测定时，需提供建立HPLC法的依据及参考文献。
2．应对建立的方法进行论证，按照中国药典2000年版二部凡例与附录收载的药品质量标准分析方法验证项下所列的要求进行试验。
3．建立方法时，应考虑下列事项：
①首选填料为十八烷基键合硅胶，并至少对两根不同品牌的色谱柱进行比较试验，其中一根为国产柱。
②流动相首选甲醇-水系统，应尽可能少用含有缓冲液的流动相，如为碱性药物，流动相的pH值应为7~8；如为酸性药物，流动相的pH值应为3~4。
③尽可能选用流动相作为溶剂，如未能选用，应说明原因。
④内标物应首选易得到的纯度较高的化学试剂或对照品，应与待测物质化学结构相似，理化性质接近，峰的响应值相当，以及分离度应大于1.5，另应考虑对照品的来源问题。
⑤检测器首选UV检测器。
4．采用HPLC法进行有关物质检查时，如杂质峰的响应值与主成分峰的响应值相差太大，应首选自身对照法，而不宜选用面积归一化法。
5．HPLC法用于原料药的含量测定。如以内标法测定含量，应考虑内标物是否含有干扰供试品的杂质；如以外标法测定含量，对照品与供试品应各取样2份，对照晶溶液各进样3次，供试品溶液各进样2次，计算相对标准差（RSD应不得大于l.5％）。
二、对复核单位的要求：
1．按照起草单位提供的色谱条件与方法进行复核。
2．当HPLC法用于有关物质的检查时，应进行最低捡出量试验。
3．应考虑对同一样品分析结果的重现程度、方法的可行性，并作出评价。(下
