21.（共13分）人体内的t-PA蛋白能高效降解由纤维蛋白凝聚而成的血栓，是心梗和脑血栓的急救药。通过基因工程技术可以大量制备基因工程药物t-PA。
(1)研究人员采用PCR技术可以获得大量t-PA基因，PCR的原理是_______________。此外，大量获得t-PA基因的方法还有___________________（答出1种）。
(2)高质量的DNA模板是成功扩增目的基因的前提条件之一，在制备DNA模板时，可以用高温处理的方法去除其中的蛋白质，原因是________________。
(3)研究表明，为心梗患者注射大量t-PA会诱发颅内出血，其原因在于t-PA与纤维蛋白结合的特异性不高，若将t-PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，能显著降低出血副作用。据此，先对天然的t-PA基因进行序列改造，然后再采取传统的基因工程方法表达该改造后的基因，可制造出性能优异的改良t-PA蛋白。（注：如图1表示相关的目的基因、载体及限制酶。pCLY11为质粒，新霉素为抗生素。）请回答下列问题：
①以上制造出性能优异的改良t-PA蛋白的过程被称为___________。已知人t-PA基因第84位半胱氨酸的模板链碱基序列为ACA，而丝氨酸的密码子为UCU，因此改造后的基因决定第84位丝氨酸的模板链的碱基序列应设计为___________。
②如图所示，需选用限制酶XmaI和___________切开质粒pCLY11，才能与t-PA改良基因高效连接。与单一酶酶切相比，本操作采用的双酶切方法的优点是___________。
③将连接好的DNA分子导入大肠杆菌，含t-PA改良基因重组DNA分子的细胞应具有的性状是________
A．新霉素抗性且呈蓝色 B．新霉素敏感且呈蓝色
C．新霉素抗性且呈白色 D．新霉素敏感且呈白色
【答案】
(1) DNA半保留复制（DNA双链复制）(2分) 从基因文库中获取(2分)
(2)蛋白质在高温条件下会变性失活，而DNA虽然在高温时会变性，但在低温时又会复性。(2分)
(3) 蛋白质工程 (1分) AGA (1分) BglⅡ(1分)
防止质粒载体（和目的基因）自身环化(2分) C(2分)
【解析】
(1)PCR是指体外合成DNA的技术，其原理是DNA半保留复制。对于基因比较小，核苷酸序列已知，也可以直接使用DNA合成仪用化学方法直接人工合成，此外还可从基因文库中直接获取。
(2)根据蛋白质在高温条件下会变性失活，而DNA虽然在高温时会变性，但在低温时又会复性的特征，在在制备DNA模板时，可以用高温处理的方法去除其中的蛋白质，从而获得较纯净的DNA模板。
(3)①天然的t-PA基因控制t-PA蛋白的合成，改良t-PA蛋白需要对天然的t-PA基因进行序列改造，然后用改造的基因作为目的基因让其表达，从而实现对天然蛋白质的改造，题中性能优异的改良t-PA蛋白的过程被称为蛋白质工程，已知人t-PA基因第84位半胱氨酸的模板链碱基序列为ACA，而丝氨酸的密码子为UCU，根据碱基互补配对原则可推测，改造后的基因决定第84位丝氨酸的模板链的碱基序列应设计为AGA。
②目的基因两端的黏性末端图中已经给出，观察各限制酶的识别序列可知，限制酶XmaI和BglⅡ切割产生的粘性末端能与目的基因的黏性末端碱基互补，要想把目的基因与质粒pCLY11 （运载体） 拼接起来需要得到相同的黏性末端，因此质粒pCLY11（运载体）也需要限制酶Xma和BglⅡ切割；基因工程中最核心的一个环节为基因表达载体的构建，其的是让目的基因在受体细胞中稳定存在并且遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用，这里用两种不同的限制酶切割质粒的目的是为了使其呈现两种不同的黏性末端分别与目的基因的两个黏性末端连接，这样可以保证目的基因和质粒的正向连接，同时也可避免目的基因和质粒的自身环化。
③结合 图示可知，限制酶XmaI和BglⅡ会破坏质粒pCLY11上的mlacZ，但不会破坏neor（新霉素抗性基因），导入重组质粒的大肠杆菌具有新霉素抗性，但由于mlacZ基因被破坏，因而菌落呈现白色，而导入pCLY11质粒的大肠杆菌，既有新霉素抗性，且mlacZ基因也能正常表达，因而菌落呈现蓝色。当然这里作为受体细胞的大肠杆菌应该不具有pCLY11质粒，据此可将成功导入目的基因的大肠杆菌筛选出来。
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