今天我们邀请冰糖来介绍 lentiCRISPR v2 应用指南。
克隆 gDNA 使用 BsmBI 位点,载体可以切出一个~1.9 kb 的 filler 片段,便于 confirm 酶切成功并利于载体回收。
BsmBI 的位点如图所示:
酶切之后不需要 CIP 脱磷也不会自连。
Cas9 的 COOH 端带有 FLAG tag, 可以 WB 或者 Immunostaining。
EFS promoter 被优化的小而强,极大提高了慢病毒包装的效率。
载体带有 Puromycin 抗性,可以富集转染/感染成功的细胞。
参考文献:
Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPRscreening. Sanjana NE, ShalemO, Zhang F. Nat Methods. 2014 Aug;11(8):783-4. doi:10.1038/nmeth.3047. 10.1038/nmeth.3047 PubMed 25075903
gDNA 设计方法和原则请查看「CRISPR/Cas9 系统操作指南一」。请加颜值担当菌菌,微信号:biotalk。注明 protocol 就会给到你《CRISPR/Cas9 系统操作指南一》。
对于 lentiCRISPR v2 克隆,其合成的 oligo 末端和 pX330 不同,请注意设计。
举个例子说明(千万注意 oligo 的方向)
1.Backbone 的酶切体系与文章「CRISPR/Cas9 系统操作指南一」一样,不脱磷处理参考图 1 中的操作,脱磷处理参考图 2 中的操作。
2.Oligo 的退火条件也与文章「CRISPR/Cas9 系统操作指南一」一样。
注意:如果载体不脱磷,oligo 不需要磷酸化;载体脱磷参考图 2(FengZhang 提供的 protocol,设计脱磷,可以参考),oligo 就需要加磷处理。
图 1
包装病毒使用的包装体系如下(for 100 mm dish, 6x106 293T)
4 μg | lentiCRISPR v2-gDNA plasmid |
3 μg | psPAX2 packaging plasmid |
2 μg | pMD2.G envelope plasmid |
转染条件:用细胞转染试剂 lipofiter。DNA:lipofiter=1 μg:2.5 μL
收集 48 h 和 72 h 病毒上清,待用。
此处病毒包装的 protocol 没有列出,如果想看,请加颜值担当菌菌,微信号:biotalk。注明 protocol 就会给到你《CRISPR/Cas9 系统操作指南一》。
转染 (2μg plasmid/60 mm dish,细胞密度 60~80%)【v2=lentiCRISPR v2,下同】
感染 (1~5 mL 病毒上清)【v2=lentiCRISPR v2,下同】
有限稀释法:50~100 cells 均匀分到 96-well plate
单克隆挑取法
直接测序或者 T7E1 或者酶切鉴定:鼠尾直接 PCR 试剂盒 (快速基因型鉴定) ,直接取细胞进行 PCR,然后测序或者做 T7E1 或者酶切鉴定即可。
WB 鉴定
如果抗体好用,直接用 Dot blot 也很快, 通量高。
文章来源:文章由冰糖授权转载
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