一 液体培养基配方:葡萄糖 20克 蛋白胨 10克 硫酸镁 0.5克 硫酸二氢钾 1克 水 1000ml
二 液体培养基的制作步骤 :
1 称量 溶解:按配方称量药品,将药品置于烧杯中加水,玻璃棒搅匀。
2 分装:分装三角瓶时避免培养液黏住瓶壁口,用漏斗进行分装,三角瓶装料系数60%。
3 加棉塞:棉塞大小,松紧度要适中,一般塞入3-4厘米。
4 装锅灭菌:塞好棉塞的三角瓶用双层报纸包扎好,装入灭菌锅,盖上报纸,排气后,待温度升至121℃开始计时,温度控制在121—123℃,维持50min。
5 烘棉塞:当压力降至0.05MPa时带压进入无菌室,当压力即将降至零时开始放气,打开锅盖拿出报纸,将锅盖嵌一小缝,以此来烘干棉塞, 维持40—50min。
6 冷却:取出三角瓶放在超净工作台或接种箱中,冷却后进行接种。
三 接种工艺 :
A 母种为试管菌种的接种工艺
1 选取新培养好的试管斜面菌种1支(若从冰箱中取出需提前24小时活化),松动三角瓶的棉塞,以备接种方便,在酒精灯火焰旁将棉塞顺时针旋转松动,放在一旁,拿起接种钩在火焰上烧红,并慢慢倾斜灼烧,接种时伸入试管琼脂下部,快速冷却,除去菌种前端菌丝和气生菌丝。
2 右手拔出三角瓶棉塞握在手里,用接种钩挑取斜面的50%切成4×4mm的接种块5-6块,迅速放入三角瓶中。
3 试管菌种迅速放回酒精灯旁,接种钩也放回试管中,棉塞再次塞入时要经过灼烧。
4 取双层报纸包扎好瓶口,在三角瓶上贴好标签,注明菌种明称,培养基配方,接种日期,然后放到摇床上进行培养。
5 清洁超净工作台。
B 母种为平皿菌种的接种工艺
1 选取新培养好的平板菌种一个(若从冰箱中取出需提前24小时活化),松动三角瓶的棉塞,以备接种方便,在酒精灯火焰旁将棉塞顺时针旋转松动,放在一旁,而后在酒精灯旁将平板封口膜撕掉,拿起接种钩在火焰上烧红,并慢慢倾斜灼烧,接种时将平皿盖打开放在一旁,在平板菌种上进行划线(中间接种块不纳入接种部分)平均接种块为0.5*0.5cm,划线后接种钩暂放在试管架上。
2 右手拔出三角瓶棉塞握在手里,用接种钩挑取4-5块接种块,迅速放入三角瓶中。
3平板菌种迅速放回酒精灯旁,接种钩也放回平皿中,棉塞再次塞入时要经过灼烧。
4 取双层报纸包扎好瓶口,在三角瓶上贴好标签,注明菌种明称,培养基配方,接种日期,然后放到摇床上进行培养。
5 清洁超净工作台。
四 液体菌种的培养:
1 三角瓶置于摇床上或者磁力搅拌器上进行培养,温度控制在23—24℃,转速或频率逐渐升高。
2 定时观察培养液颜色,菌球形态,如发现异常立即进行鉴定(测ph,镜检菌丝,取样培养)。
3 菌龄一般控制在6—8天,此时培养液内出现大量菌球,培养液呈黄白色,带有苹果酸味道。
4 将培养好的液体种子进行综合检测后供给发酵罐进行接种,待发酵罐接种后同时对液体种子进行镜检、空培养、取样。
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