菟丝子体外和在体实验中对黑素代谢的作用评价

研究背景色素障碍性皮肤病(如白癜风、黄褐斑)是临床中常见的皮肤疾病,其对形象的损毁给患者带来巨大的心理压力,自古以来一直受到医界的重视,而在亚洲,普通人群对于皮肤美白等美容方面的要求也越来越高,从自然界寻找安全有效的美白剂早已是化妆品界的研究热点。随着分子生物学技术的迅速发展及不同模型的出现,黑素代谢的相关研究取得了极大的进步,中医药在黑素代谢中的作用也积累了丰富的研究成果。然而,由于所选模型不一致,或者药物提取方法不同,部分中医药对黑素代谢的作用时而出现不一致的结果,究其机制却鲜有深入的探讨。本课题在结合古代和现代中医药对黑素代谢作用的基础上,选用菟丝子为实验药物。早在《神农本草经》中菟丝子就被记载有“汁去面皯”的作用,“皯”即黑斑、黧黑斑的意思。菟丝子的功能主治国家标准首次收载于1963年版《中国药典》,记载为：补肝肾,益精,明目。主治腰膝痠痛,遗精,目暗,尿频余沥。未提及菟丝子的外用功效,自1985年修订版开始,历经各次修订,各版均增加了“外治白癜风”的主治标准,2010年版则修订为“外用消风祛斑…外治白癜风”,但功效表述为“滋补肝肾,固精缩尿,安胎,明目,止泻”,未能为外治功效提供理论依据。文献检索提示,国外的实验研究认为菟丝子能抑制黑色素合成,可用于增色性皮肤病的治疗,未见菟丝子促进黑色素合成的报道；与之相对应的,近现代以来,国内对菟丝子治疗增色性皮肤病的研究较少,其应用于内服方或外治白癜风则更为常见。根据文献,在促进黑色素合成和抑制黑色素合成的研究中菟丝子均被认为发挥调节作用,但菟丝子的作用机理尚无进一步的揭示。菟丝子是否具有双向调节黑素代谢的作用?其调节机制如何?作为色素障碍性皮肤病临床治疗中应用广泛而且有效的一味中药,菟丝子常用于治疗表现完全相反的两类色素障碍性皮肤病,但其发挥作用的机制并不明确,这给临床用药带来了一定的混乱,我们认为对菟丝子的作用机制进一步深入研究具有非常重要的现实意义。色素代谢的研究模型可以分为三类：非细胞模型测试系统,细胞模型测试系统,动物模型测试系统。蘑菇酪氨酸酶是研究受试药物对酶抑制机理最常用的非细胞测试模型,酶法测试的优点是无需细胞培养、简单快速,可对受试物的作用类型进行初步的判断,缺点是体系过于简单,单凭受试物对酪氨酸酶活性的抑制程度判定其作用效果显得片面；细胞测试系统可反应不同受体基因表达的变化,一定程度上弥补了蘑菇酪氨酸酶的缺陷。最常用的细胞是小鼠B16黑色素瘤细胞,其基因组成与人表皮黑素细胞有较高的相似性,较后者相比更容易获取、培养,是用于测试受试物对黑素细胞生物学功能影响的首选模型之一。动物测试系统主要包括C57小鼠、无毛小鼠、豚鼠、Smyth line鸡等。斑马鱼作为国际标准化组织认可的5种鱼类模式生物之一,具有与人类相似的黑色素细胞和黑素体,近年来也越来越多的被用于黑素代谢研究领域。又因周身透明,色素细胞在个体发育过程中易被识别、观察,在黑素细胞遗传学、色素代谢相关模型构建、高通量药物筛选中均已得到大量的应用；此外,斑马鱼属低温低氧鱼,其耐寒性和耐热性都很强,饲养容易,产卵量大,与前几种动物模型相比有特有的优势,在黑素细胞相关研究中将有不可替代的地位。虽然斑马鱼在中医药对血管系统、中药毒理学研究中已有所应用,但作为黑素代谢研究的优势模型,斑马鱼在中医药对黑色素合成中的作用研究尚未有报道。本研究的目的明确菟丝子对黑素代谢中的调节作用及机制；探索斑马鱼模型在中医药黑素代谢实验中的应用。本研究的实验内容及结果菟丝子临床使用的剂型主要为水煎剂或酊剂,根据这一用药传统,本课题分别用水、95%乙醇对其回流提取制成了菟丝子水提物(WFSC)、菟丝子醇提物(EFSC)。选用蘑菇酪氨酸酶、B16黑素瘤细胞酪氨酸酶提取液、B16黑素瘤细胞、斑马鱼胚胎作为模型,通过体外实验和在体实验两种方式,系统研究菟丝子对黑素细胞色素代谢的作用机制,并借助高效液相色谱法分析WFSC、 EFSC成分的差异。1.在体外实验,本论文首先以蘑菇酪氨酸酶为研究对象,探讨菟丝子提取物WFSC、EFSC对蘑菇酪氨酸酶活性的作用机理；以粗制的B16黑素瘤细胞酪氨酸酶为研究对象,比较菟丝子不同提取物对这两种酪氨酸酶活性的作用。再将WFSC、EFSC与B16黑素瘤细胞共同孵育,研究其对细胞增殖、酪氨酸酶活性、黑色素合成以及对酪氨酸酶mRNA、蛋白表达的影响,相关研究内容及结果详述如下：1)分别比较了WFSC、EFSC对蘑菇酪氨酸酶活性的作用。研究结果表明WFSC对蘑菇酪氨酸酶具有抑制作用,EFSC对蘑菇酪氨酸酶则有激活作用。对WFSC, EFSC的作用机理研究显示,二者与蘑菇酪氨酸酶的结合均为可逆性,通过酶动力学实验测试,WFSC对蘑菇酪氨酸酶的活性的抑制作用表现为反竞争型抑制剂,即主要通过与蘑菇酪氨酸酶-底物复合物结合发挥作用；与蘑菇酪氨酸酶相比,WFSC对B16黑素瘤细胞酪氨酸酶提取液的抑制效果相一致。与WFSC表现出抑制作用不同的是,EFSC对蘑菇酪氨酸酶、B16细胞酪氨酸酶提取液体系中均表现为激活作用。2)研究WFSC、EFSC对B16黑素瘤细胞增殖、细胞内酪氨酸酶活性、黑色素含量的影响。结果表明浓度为0.5～20mg/mL时,WFSC、EFSC对B16细胞增殖均无影响。将WFSC、EFSC配制成不同浓度与B16黑素瘤细胞共同孵育48h后测定细胞内酪氨酸酶的活性。与IBMX作用下的空白对照组比较,WFSC作用下的B16瘤细胞TYR活性有统计学差异(F=31.726, P=0.000), WFSC对酶活性表现为抑制作用,当WFSC>5mg/mL时,差异均有统计学意义(P<0.05),WFSC中剂量组和高剂量组间差异无统计学意义(P=0.784)。与空白对照组比较,EFSC B16黑素瘤细胞酪氨酸酶的活性表现出激活作用(F=8.259,P=0.008),在5～10mg/mL时对,差异均具有统计学意义(P<0.05),但中剂量组与高剂量组间差异没有统计学意义(P=1.000)。与空白对照组比较,WFSC等药物组作用下的B16瘤细胞黑素含量差异有统计学意义(F=9.733,P=0.001), WFSC可下调酪氨酸酶黑素合成量,当WFSC>5mg/mL时,差异均有统计学意义(P<0.05), WFSC中剂量组和高剂量组间差异无统计学意义(P=1.000)。与空白对照组比较,EFSC对B16黑素瘤细胞黑素合成表现出激活作用(F=12.077,P=0.002),在5～10mg/mL时差异均具有统计学意义(P<0.05), EFSC中剂量组与高剂量组间差异没有统计学意义(P=0.18)。3)研究VFSC、EFSC对TYR的mRNA和蛋白表达的影响,结果表明,WFSC、EFSC对TYR mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)；同样,二者对TYR蛋白合成差异无统计学意义(P>0.05)。2.在体实验中,以斑马鱼为模型,以熊果苷、对羟基苯甲醚(MQ)为阳性对照,观察WFSC、EFSC对斑马鱼黑素细胞的作用,并通过PTU干预,初步探究菟丝子对斑马鱼黑素细胞发挥作用的机制；检测各受试物对斑马鱼黑素细胞酪氨酸酶活性、黑色素合成的影响,相关研究结果如下：0.1mg/mL～2mg/mL的EFSC对斑马鱼胚胎生存率没有影响；药物浓度>3mg/mL可延迟斑马鱼胚胎的发育,且随着药物浓度的增高,其生成率降低。经观察发现,WFSC、EFSC均不影响斑马鱼黑素细胞的迁移和分布。较高浓度WFSC作用下可见斑马鱼黑素细胞呈点状改变,与对照药MQ的表现相同,这一现象在加药后6h即可观察到,另一阳性对照药熊果苷也可以使斑马鱼黑素细胞出现同样的改变,但于加药后约20h方出现变化,较WFSC出现形态学改变的时间晚；EFSC对斑马鱼胚胎黑素细胞则没有明显的改变。PTU是酪氨酸酶阻滞剂,在PTU干预下,WFSC、MQ对黑素细胞的作用消失,但熊果苷仍可使黑素细胞形态发生改变,这一作用差异可能因WFSC、熊果苷对酪氨酸酶的抑制作用方式不一样有关。2)提取斑马鱼胚胎蛋白后测定酪氨酸酶活性,WFSC作用下斑马鱼黑素细胞TYR活性差异有统计学意义(F=13.006,P=0.000)。与空白对照组相比较,WFSC浓度为lmg/mL～3mg/mL时对斑马鱼黑素细胞酪氨酸酶表现出抑制作用,差异均有统计学意义(P<0.05),各浓度组间差异均无统计学意义(P>0.05)。WFSC、熊果苷、MQ对酪氨酸酶的作用差异无统计学意义(P>0.05)。WFSC作用下,斑马鱼黑素细胞黑色合成作用差异有统计学意义(F=16.474,P=0.000)。与空白对照组相比较,WFSC浓度为lmg/mL～3mg/mL时对斑马鱼黑素合成表现出抑制作用,差异均有统计学意义(P<0.05),各浓度组间差异均无统计学意义(P>0.05)。WFSC为3mg/mL时,与熊果苷、MQ相比,对黑素合成的作用差异均无统计学意义(P>0.05)。EFSC对斑马鱼黑素细胞酪氨酸酶活性未表现出影响(F=0.831,P=0.535),不同浓度EFSC对斑马鱼胚胎黑素合成形成的差异无统计学意义(F=0.596,P=0.674)。3.高效液相色谱法对WFSC、EFSC的成分分析：在实验过程中我们发现,WFSC在提取初期对酪氨酸酶没有抑制作用,反而表现出轻微的促进作用,至其提取后1个月方表现出明显的抑制作用,抑制效果稳定并维持直至提取后6个月；而EFSC自提取后即对酪氨酸酶活性表现出稳定的激活作用。参考苏薇薇等建立的实验方法,本研究对不同时期WFSC、 EFSC进行了高效色谱法分析,相关结果如下：1) WFSC、 EFSC的HPLC图谱有明显的差异,WFSC在提取后2周内峰6逐渐低平直至消失,而其提取1个月后与6个月后的HPLC图差异不大,这与WFSC药效变化的时间拐点相符合；与WFSC不同的是,EFSC的HPLC图谱随时间变化差异不大,峰5是EFSC的特有峰,菟丝子主要由多酚类化合物组成,其中含有丰富的黄酮类成分,根据流动相设置条件及出峰时间判断,峰5可能为黄酮类化合物。2) WFSC对斑马鱼黑素细胞黑色素合成有抑制作用,为研究WFSC在斑马鱼作用下成分的变化,对经或不经斑马鱼胚胎作用的含有WFSC的培养液进行分析,发现经斑马鱼胚胎作用后,23min峰高明显下降,而39min峰高明显升高,推测此两种化合物含量的变化可能与WFSC对斑马鱼胚胎黑素细胞的抑制作用相关。结论1.不同的提取方法下,菟丝子的成分变化差异明显,其中水提物表现为抑制作用,醇提物表现为激活作用,菟丝子对黑素代谢的这种双向作用可能是由于各提取部位的成分不同引起的；2.斑马鱼胚胎在菟丝子对黑素代谢的研究中与其它模型表现出较好的一致性,且更为直观,可应用于中医药对黑素代谢的实验研究。讨论通过本课题的研究,体外试验和在体实验结果均表明菟丝子水提物WFSC对黑色素合成具有抑制作用,经蘑菇酪氨酸酶检测,WFSC为反竞争型抑制剂,表明其是通过酪氨酸酶-底物复合物发挥抑制作用的；WFSC对B16黑素瘤细胞及斑马鱼胚胎黑素细胞生物学功能的作用一致,即通过降低酪氨酸酶活性下调黑素合成量,WFSC作用下斑马鱼胚胎黑素细胞的形态发生改变,与熊果苷作用效果相似,但二者的起效时间不同。醇提物EFSC在细胞外酪氨酸酶模型及B16黑素瘤细胞实验中对酪氨酸酶活性及黑色素合成表现出激活作用,然而在斑马鱼黑素细胞却无明显影响,这可能因斑马鱼胚胎发育早期的黑素细胞酪氨酸酶活性本身较高有关,在斑马鱼胚胎发育的早期(12hpf-5dpf),酪氨酸酶活性高于其成熟的黑素细胞,因而EFSC的激活作用无从体现。HPLC图谱表明WFSC的变化与其药效发生改变的时间变化相一致；而峰5为EFSC的特有峰,根据色谱条件及峰5所在的位置,且其紫外吸收图与槲皮素对照品相似,推测其可能为母核与槲皮素相似的黄酮类化合物。WFSC经斑马鱼胚胎作用前后的HPLC图谱显示其组成有明显变化,23min峰明显降低,39min峰明显升高,二者改变是否与WFSC的抑制作用有关?峰5是否是EFSC发挥药效的关键组成?峰6是否为WFSC作用产生变化的关键峰?这些问题尚未解决,有待课题组进一步的深入研究。创新及展望1)本课题因菟丝子对黑素代谢作用描述不清给临床用药带来困惑这一现实问题的目的,以不同模型为对象,研究菟丝子对黑素代谢的作用,实验证实菟丝子对黑色素代谢的作用具有双向性,发现其药效差别的关键因素可能是因提取方法不同导致的有效成分不同,其中水提取产物WFSC对黑素合成具有抑制作用,醇提取物EFSC对细胞内的色素合成有激活作用。2)首次发现WFSC对黑素合成的抑制作用存在时间拐点,推测与其组成成分发生变化有关。3)本课题首次将斑马鱼胚胎用于中医药对黑素细胞作用的研究,与其他模型相比更为直观、便利,而且有较好的一致性。综上所述,本课题具有一定的创新性及科学意义。然而,本课题未能展开菟丝子复方及与不同功效中药配伍对黑素代谢影响的研究,临床应用中药调控色素实践的诸多问题,仍需进一步的探讨。