IL-33通过17β-雌二醇激活ST2/MAPK/MMP-9通路增强人卵巢子宫内膜异位症基质细胞的侵袭（万丽琴译）

子宫内膜异位症是一种雌激素效应，孕激素抵抗为基础的慢性炎性疾病。这种慢性炎症导致严重临床后果，其他生发展是一个复杂过程。

子宫内膜异位症慢性炎症涉及内分泌，细胞和体液免疫，分子免疫与遗传背景和表观遗传学等。临床子宫内膜异位症所致的生殖和产科后果，以及子宫内膜异位症导致的胎停，反复种植失败，流产，复发流产，大月份流产，脐带扭转或螺旋缠绕，胎儿宫内窘迫，或胎死宫内，大月份早产等众多后果。

然而，由于临床医生缺乏分子病理生理学相关知识，缺乏药理毒理学知识，对分子信号通路等相关基础分子机制严重不了解，甚至一无所知；对国际基础研究和临床基础或临床研究的进展不了解，或从未阅读，因此导致子宫内膜异位症产生的生殖和妇产科病理后果无法认知。

甚至错误将子宫内膜异位症相关问题归为免疫问题，十分无知，对分子病理生理与药理毒理学知识的缺乏，常常令人震惊。

由于专业知识层次和认知水平的不足，导致了子宫内膜异位症相关的复发性流产，大月份流产和早产，宫颈机能不全相关认知陈旧落后，甚至愚蠢状态。

盲目的免疫套路检查和用药，对遗传学和胚胎发育生物学完全无知状态下，导致子宫内膜异位症等临床诸多问题久拖不决，盲目保胎或盲目免疫套路导致诸多诊疗血泪史。

临床专业知识的积累需要一个长期过程，特别是医学遗传学知识的缺乏，让大量临床医生对分子病理生理学认知甚少。对分子药理毒理学并不熟悉，用药盲目而缺乏循证依据。

特别突出的就是大量无知使用免疫球蛋白，粒细胞刺激因子，肿瘤坏死因子融合蛋白等生物制剂，盲目无指征用于保胎，相关分子病理生学机制和分子药理毒理学机制不专业，对胚胎质量相关的医学遗传学基础完全无知，临床乱象丛生。

子宫内膜异位症是一个复杂问题，每个病例均需要医生细节严谨深入分析，子宫内膜异位症相关炎症机制国际研究进展很多。

此次，若光医学中心进修医生万丽琴主任翻译了王若光教授发来的三篇国际文献，以期进一步提高临床医生对子宫内膜异位症认知层次和水平。相关文献很多，后期我们再一一发出来。

IL-33通过17β-雌二醇激活ST2/MAPK/MMP-9通路

增强人卵巢子宫内膜异位症基质细胞的侵袭

这是一篇来自于台湾的研究报告。

万丽琴译

研究目标：子宫内膜异位症是一种雌激素依赖性的良性慢性妇科疾病，常发生在育龄妇女中。虽然子宫内膜异位症的发病机制尚不清楚，但着床理论表明，有活力的子宫内膜细胞可随月经逆行从子宫内膜脱落到盆腔腹膜或卵巢，然后重新附着、侵入并损伤其他组织。IL-33是IL-1超家族的新成员，促炎因子刺激后由基质细胞上调IL-33水平。基质金属蛋白酶(MMPs)参与细胞外基质的降解和重建。MMP-9通过促进子宫内膜异位症细胞的侵袭来参与子宫内膜异位症的发病过程。本研究探讨了IL-33对人卵巢子宫内膜瘤基质细胞（hOVEN-SCs）侵袭能力及MMP-9表达的影响。

研究方法：从卵巢子宫内膜中分离出hOVEN-SCs，采用Illumina Human WG-6 v2 expression BeadChips微阵列平台和逆转录聚合酶链反应分析基因表达。使用Transwell chamber试验评估细胞的迁移和侵袭。

【Illumina Human WG-6 expression beadchips：每张芯片可平行检测 6 个样本，包含有48,000 个基因转录本 . ，信息来源除 24,000 个 NCBI RefSeq 外，还包含了从 UniGene, RefSeq Gnomon, Genome-Annotation RefSeq 的 24,000 个转录本信息。】

研究结果：hOVEN-SCs中，我们发现17β-雌二醇可以通过雌激素受体途径增加 IL-33和ST2的表达。此外，IL-33通过ST2/MAPK信号通路上调hOVEN-SCs中MMP-9的表达，增强其侵袭能力。结果表明，MMP-9的表达对il -33诱导的细胞侵袭至关重要。

研究结论：我们的主要发现是17b-雌二醇可以通过雌激素受体途径增加IL-33的表达，并通过IL-33/ST2/MAPK信号通路激活hOVEN-SCs中MMP-9的表达和侵袭能力。本研究结果及进一步相关研究可能为子宫内膜异位症的预防和治疗提供新的策略。

概述

子宫内膜异位症被认为是一种雌激素依赖性、良性、慢性炎症性疾病，其特征是子宫内膜组织存在于子宫腔外。不孕和剧烈疼痛是子宫内膜异位症的主要症状。目前，关于子宫内膜异位症的发病机制提出了各种各样的理论；然而，其潜在机制尚不清楚。着床理论认为，有活力的子宫内膜细胞可能通过月经逆行从子宫内膜脱落到盆腔腹膜或卵巢，这些细胞随后附着、侵入并损伤其他组织。基于这一理论，这些子宫内膜细胞的生长是子宫内膜异位症的重要因素。

炎性细胞因子如TNF-α、IL-1b、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13参与子宫内膜异位症的发病。IL-33是IL-1家族的核细胞因子，在多种细胞中表达，包括内皮细胞、上皮细胞、免疫细胞和基质细胞。IL-33主要通过结合和激活其受体ST2 (IL-1家族受体成员)介导其生物学功能和病理生理作用。IL-33与ST2结合，通过激活NF-kB和MAPK通路，包括ERK1/2、p38和JNK，增强细胞因子的产生和释放。越来越多的证据表明，IL-33在多种慢性炎症疾病、自身免疫性疾病、哮喘、组织纤维化和心血管疾病中高表达并起关键调节作用。

子宫内膜间质细胞产生IL-33，特别是在蜕膜化的过程中，这表明它在胚胎着床和早期妊娠等女性生殖事件中起着至关重要的作用。IL-33在子宫内膜异位症进展中的作用尚未得到很好的证实。据报道，深度浸润性子宫内膜异位症患者血清和腹膜液中IL-33浓度升高，IL-33可能是促进炎症和子宫内膜异位症进展的关键因素。因此，IL-33信号通路可能是治疗子宫内膜异位症的一个有价值的靶点。

多项研究表明子宫内膜异位症与子宫内膜异常迁移和侵袭有关。MMP是参与细胞外基质降解和重建的重要物质，在细胞迁移、侵袭和转移中起着至关重要的作用。此外，研究报道MMPs在异位子宫内膜中的表达水平高于在位内膜。在MMPs中，MMP-2和MMP-9与子宫内膜异位症的进展关系最为密切，许多关于MMP-9的研究表明，子宫内膜异位症女性异位子宫内膜组织中MMP-9的表达增加，MMP-9通过促进子宫内膜异位症病变的侵袭参与了子宫内膜异位症的发病过程，此外，MMP-9/TIMP-1(一种已知的MMP-9前体和活性形式的天然抑制剂)的失衡参与了子宫内膜异位症患者子宫内膜组织的侵袭，这些均表明MMP-9在子宫内膜异位症的发病机制中发挥了重要作用。

有研究报道IL-33/ST2信号转导通路通过引起MMP-9和TIMP-1的失衡参与肺纤维化过程，并通过上调MMP-9参与胶质瘤细胞的侵袭和迁移，此外，IL-33/ST2信号转导通路通过ERK1/2-MMP-2/-9通路调控黑色素瘤血管生成，增强巨噬细胞中MMP-9的表达。但目前没有关于IL-33暴露对人子宫内膜异位症基质细胞中MMP-9表达的影响的研究。

子宫内膜异位症的发病机制是多因素的，涉及炎症因子和内分泌通路的相互作用。许多研究表明，雌激素信号通路的不平衡可能在子宫内膜异位症的进展中起关键作用。在先前的致病机制研究中，我们发现异位子宫内膜间充质干细胞通过IL-1β和环氧化酶-2获得细胞迁移和侵袭能力。本研究探讨了IL-33对hOVEN-SCs基质细胞侵袭能力和MMP-9表达的影响。研究结果表明17β-雌二醇可通过雌激素受体途径增加IL-33的表达，并通过IL-33/ST2/MAPK信号通路激活人子宫内膜异位症基质细胞MMP-9的表达和侵袭能力，从而促进子宫内膜异位症的发生。

材料与方法

hOVEN-SCs的分离与培养

如先前所述，人类间质细胞是从卵巢子宫内膜异位症组织(子宫内膜异位症)中发育和分离出来，这些组织来源于通过手术治疗子宫内膜异位症的患者，且使用得到了医院机构委员会的许可。将hOVEN-SCs培养于含5%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的无酚红DMEM/F12培养基中。台盼蓝染色法测定细胞活力。当细胞达到80%聚集时，胰酶化并传代培养，早期传代细胞用于后续试验(传代2)。

比较17β-雌二醇处理的hOVEN-SCs与hOVEN-SCs基因表达谱

使用TRIZOL试剂提取17β-雌二醇处理的hOVENSCs和hOVENSCs的全RNA，并将其用于Illumina Human WG-6 v2 Expression BeadChips微阵列平台。全基因组mRNA表达谱的方法见最近发表的文献。受刺激细胞的基因表达倍数变化计算方法为平均信号值相对于对照细胞的平均信号值，显著的调节被定义为发生10倍变化。

逆转录聚合酶链反应

用TRIZOL试剂从细胞中提取总RNA，用Superscript IV First-Strand Synthesis System试剂盒进行逆转录，用基因特异性引物在PCR机上扩增cDNA。引物为IL-33 (正向: 50-TCCAACTCCAAGATTTCCCCG-3'; 反向: 50-CATGCAGTAGACATGGCAGAA-30),ST2 (正向: 50- CTTGATTGATAAACAGAATG -3'; 反向: 50-CTGATCCAGATACTGTTGAA-30), MMP-9 (正向:50-GGGACGCAGACATCGTCATC-3';反向: 50-CGTCATCGTCGAAATGGGC-30) 和β-肌动蛋白 (正向, 50- ATGATATCGCCGCGCTCGTCGTC-3'; 反向, 50-GCTCGGCCGTGGTGGTGAA-30)。扩增产物在2%琼脂糖凝胶上分离，溴化乙啶染色后用于定量测定光密度。为了比较基因表达，除了使用相同的方案和条件外，我们还使用β-肌动蛋白作为内参基因来标准化mRNA水平。该方法可提供相对定量的比较。结果以三个重复的平均值±标准差(N¼3)表示，并进行统计学检验。

迁移和侵袭试验

将细胞接种到24孔Falcon™Migration插入物和Matrigel™Invasion插入物中(两个插入物孔径均为8mm)。将插入物置于Falcon伴板中，孵育18小时用于迁移，孵育24小时用于侵袭。孵育后，用棉签和磷酸盐缓冲盐水从顶室取出培养基和细胞。将迁移或侵袭到膜下的细胞数量固定，用0.5% (w/v)结晶紫染色，在显微镜下目测计数。所有实验一式三次(N¼3)，每个过滤器至少计算5个字段，数据以平均值±标准差表示。

免疫荧光染色

免疫荧光染色方法如前文所述，使用MMP的初级抗体和次级抗体与藻红蛋白偶联，使用尼康Eclipse Ti-S荧光显微镜观察图像，并通过连接到计算机的尼康DS-U3数码相机记录图像。

数据分析

采用学生t检验对两种不同处理的比较进行统计学分析。所示数据为平均值±标准差。P＜0.05认为有统计学意义。所有实验都独立地重复了至少三次。

研究结果

17β-雌二醇处理的hOVEN-SCs与hOVEN-SCs基因表达谱

为了了解17β-雌二醇在卵巢子宫内膜异位症中的致病机制，我们使用了Illumina Human WG-6 v2 expression BeadChips微阵列平台检测IL-17β（1μM）是否调节hOVEN-SCs的表达。我们观察到53个基因发生的变化＞10倍，在这53个基因中，与hOVEN-SCs相比，经雌二醇处理的17个hOVEN-SCs中有21个基因上调，32个基因下调。Table 1 列出了上调的21个基因。

17β-雌二醇通过雌激素受体增加了hOVEN-SCs中IL-33和ST2基因的表达

子宫内膜异位症是一种多面性疾病，可受细胞粘附、迁移、转移、血管生成、免疫和炎症等多种因素的影响。在21个上调基因中，IL-33被发现与这些因素有关。IL-33通过与其受体IL-1受体样1(也称为ST2)结合来发挥其功能。Illumina Human WG-6 v2 Expression BeadChips芯片检测结果显示，与hOVEN-SCs相比，17β-雌二醇(1 mM)处理的hOVEN-SCs中IL-33和ST2的表达分别高74.7倍和13.2倍（Table 1）。进一步验证结果表明，我们通过RT-PCR量化了IL-33和ST2的转录表达，RT-PCR结果显示，17β-雌二醇处理的hOVEN-SCs中IL-33和ST2的表达明显高于hOVEN-SCs（IL-23和ST2的表达分别增加11.6和2.8倍,Fig 1A和1B），而且雌激素拮抗剂可抑制该生物学效应（ICI I82, 780, 1 mM），提示了雌激素受体的依赖机制（Fig. 1）

IL-33增强了hOVEN-SCs的侵袭能力

为了研究IL-33对hOVEN-SCs迁移和侵袭能力的影响，我们用不同浓度的IL-33(0、1、2、3、4和5 ng/ml)处理细胞，然后进行迁移和侵袭实验。如图2A所示，IL-33处理对hOVEN-SCs的迁移能力没有明显影响，当IL-33在浓度为2、3、4和5 ng/ml时显著增加hOVEN-SCs的侵袭性，且呈剂量依赖性(Fig. 2B)。侵袭性方面，IL-33有效浓度为3 ng/ml；因此，在随后的实验中使用了该浓度。

IL-33通过ST2和MAPK途径增加MMP-9基因的表达

MMP-9过表达与子宫内膜异位症的发生有关。因此，我们检测了IL-33是否可以增强hOVEN-SCs中MMP-9的表达，RT-PCR结果显示，在IL-33 (3 ng/ml)处理的hOVENSCs中，MMP-9 mRNA水平显著高于hOVENSCs(2.1倍)（Fig. 3）。为了研究IL-33对hOVEN-SCs中MMP-9表达的影响是否由ST2介导，我们同时用IL-33和抗ST2抗体处理细胞。结果表明，抗ST2抗体可以逆转IL-33对hOVEN-SCs中MMP-9表达的增加作用。这一发现表明ST2依赖性信号通路参与了IL-33诱导的hOVEN-SCs中MMP-9的表达。接下来，为了探索MAPK通路在IL-33诱导的hOVEN-SCs中MMP-9表达中的潜在作用，我们测量了IL-33联合U0126 (MAPK激酶、MEK1和MEK2的选择性抑制剂)处理的hOVEN-SCs中MMP-9的表达; 10μM)。结果表明，U0126处理能有效抑制IL-33诱导的hOVEN-SCs中MMP-9的表达。此外，用抗ST2抗体和U0126治疗可显著抑制IL -33诱导的MMP-9表达。（Fig. 3）

Table 1

17b-雌二醇处理的hOVEN-SCs中有21个基因上调(10倍)

Fig. 1 17β-雌二醇通过雌激素受体在hOVEN-SCs中增加IL-33和ST2基因的表达。RT-PCR 分析结果显示经过17-β雌二醇的处理后的hOVEN-SCs，（A）IL-33和（B）ST2 mRNA的表达显著增加；雌激素拮抗剂可以显著逆转这两个基因在17b-雌二醇处理后hOVEN-SCs中的表达(ICI I82, 780, 1 mM; *P < 0.05)。

Fig. 2 IL-33增强了hOVEN-SCs的侵袭能力；我们用不同浓度的IL-33（0、1、2、3、4和5 ng/ml）处理了hOVEN-SCs，并通过Transwell chamber实验检测了它们的迁移和侵袭能力。(A) IL-33对hOVEN-SCs的迁移能力无显著影响。(B) IL-33(2、3、4和5 ng/ml)处理的hOVEN-SCs细胞侵袭性显著增强。在侵袭性方面，IL-33的有效浓度为3 ng/ml (*P ＜0.05)。

MMP-9介导IL -33增强hOVEN-SCs侵袭能力

通过侵袭室实验来检测IL-33是否能增强细胞的侵袭能力,在24 h内，IL-33处理过的hOVEN-SCs通过孔隙平均侵入的数量是对照组的2.6倍（分别为36.8±2.5和14.3±3.2/细胞区域，1x10³ 细胞；Fig. 4A)。即使在IL-33存在的情况下，抗ST2抗体或U0126或抗ST2抗体与U0126作用24 h，可有效逆转IL-33增强的细胞侵袭能力(28.6 ± 3.1, 21.2 ± 3.4, 和18.1 ± 4.1个/细胞区域，1x10³细胞)（Fig. 4A）。在侵袭室实验中，通过免疫荧光染色发现通过基质的细胞表达MMP-9（Fig. 4B）。这一发现与它们增强的入侵能力是一致的。综上所述，这些结果表明IL-33可以通过ST2/MAPK信号通路上调hOVEN-SCs中MMP-9的表达，增强其侵袭能力。

Fig. 3. IL-33通过ST2和MAPK途径增加MMP-9基因的表达。IL-33 (3 ng/ml)显著上调hOVEN-SCs中MMP-9 mRNA的表达，IL-33诱导的MMP-9 mRNA表达的增加可以通过抗ST2抗体和/或U0126 (一种MAPK激酶、MEK1和MEK2的选择性抑制剂，10μm; *P < 0.05)治疗显著抑制

Fig.4 MMP-9介导IL -33增强的hOVEN-SCs侵袭。（A）经IL-33 (3 ng/ml)处理的hOVEN-SCs的侵袭能力明显高于未经IL-33处理的对照组。使用抗ST2抗体和/或U0126（MAPK激酶，MEK1和MEK2的选择性抑制剂，10 μM)有效逆转IL -33诱导的细胞侵袭能力增强。（B）在免疫化学分析中，侵袭的hOVEN-SCs表达MMP-9（scale bar= 200 μm;* P＜0.05)。

讨论

本研究确定hOVEN-SCs中雌激素增强的侵袭性是否由IL-33上调介导。我们的研究结果表明，17β-雌二醇可以通过雌激素受体刺激hOVEN-SCs中IL-33和IL-33特异性受体ST2的表达，提示17β-雌二醇可以诱导炎症介质的表达。此外，我们还发现，随着IL-33浓度的增加，hOVEN-SCs的侵袭能力增强，选择性抑制ST2或MAPK可降低IL-33对hOVEN-SCs的作用，且IL -33增强的hOVEN-SCs侵袭能力是由MMP-9通过ST2/MAPK信号通路介导的。

人类子宫内膜是一个动态组织，在女性的生育年龄中经历了400多个再生、分化和脱落的周期，子宫内膜发育包括增殖和分泌两个阶段，这一过程的两个主要调节者是卵巢类固醇激素雌激素和黄体酮。许多研究表明，雌激素不仅在异位子宫内膜细胞中起增殖和分化作用，而且在异位子宫内膜细胞中也起增殖和分化作用。子宫内膜异位症的病理过程定义为子宫腔外存在异位子宫内膜组织，如卵巢和腹膜，异位子宫内膜发生粘连、侵袭和血管生成，最终发展为子宫内膜异位症。评估雌激素是否加速子宫内膜异位症进展的研究发现，雌激素可上调局灶黏附激酶的表达，促进细胞侵袭，诱导上皮细胞向间质细胞转化，并上调血管内皮生长因子的表达。在我们前期的研究中，我们发现17β-雌二醇可以促进人卵巢子宫内膜瘤源间充质干细胞的肿瘤干细胞特征，提示雌激素参与子宫内膜异位症的进展。

子宫内膜异位症是一种常见的雌激素依赖型良性慢性炎症性妇科疾病，主要由外子宫内膜组织产生炎性病变引起，导致盆腔疼痛，降低生育能力。除了在生殖中的作用，雌激素还影响许多炎症反应。雌激素对生殖和其他靶组织紊乱的病理作用可因炎症环境而加剧，但原因尚不清楚。炎性细胞因子如TNF-α、IL-1b、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13参与子宫内膜异位症的发病，然而，关于雌激素在子宫内膜异位症中诱导IL-33表达的机制研究较少。本研究发现，在hOVEN-SCs中17β-雌二醇通过雌激素受体增加IL-33和ST2的表达，表明17β-雌二醇可以增加炎症因子的表达(Table 1和Fig. 1)。

IL-33在包括子宫内膜基质细胞在内的多种细胞类型的细胞核中表达，子宫内膜间质细胞产生IL-33，特别是在去卵化过程中，这表明它在胚胎着床和早期妊娠等女性生殖事件中起着至关重要的作用。IL-33是包括炎症在内的许多过程的关键调节因子，血管新生和病变增生，均与子宫内膜异位症相关。然而，IL-33在子宫内膜异位症进展中的作用尚未得到很好的描述。在本研究中，我们发现IL-33促进了hOVEN-SCs的侵袭能力。

广泛认为IL-33/ST2可促进促炎细胞因子和趋化因子的释放，是NF-kB和MAPK通路的激活剂，包括ERK1/2、p38和JNK，此外，许多研究表明MMPs在细胞迁移、侵袭和转移中起着至关重要的作用，IL-33通过上调MMP-2和MMP-9参与侵袭和迁移。然而，IL-33促进子宫内膜异位症细胞侵袭的细胞和分子机制尚未完全阐明。本研究结果表明，IL-33可通过ST2/MAPK信号通路上调hOVEN-SCs中MMP-9的表达，增强其侵袭能力(Figs. 3 and 4)。

我们推测17β-雌二醇可以通过上调IL-33和ST2的表达激活IL-33/ST2/MAPK信号通路，增加MMP-9在hOVENSCs中的表达和侵袭。因此，IL-33可能是治疗子宫内膜异位症的有效靶点。

参考文献（略）