导读
近年来生物药的迅猛发展给许多生物技术公司带来新的契机，相信未来一段时间生物医药产业将逐渐成为全球新医药未来的发展方向。各大制药工资如何在生物创新药与生物仿制药市场的激烈竞争中抓住机会，实现利益最大化？该专题我们以粒细胞集落刺激因子为例，具体分析生物药的发展趋势，及各大制药企业的发展策略。
正文
粒细胞集落刺激因子（Granulocyte Colony Stimulating Factor,G-CSF）是刺激嗜中性粒细胞祖细胞和成熟中性粒细胞存活、增殖、分化和活化的糖蛋白，它在抗感染的非特异性细胞免疫过程中起重要作用。G-CSF临床主要用于预防和治疗肿瘤放疗或化疗后引起的白细胞减少症、治疗骨髓造血机能障碍及骨髓增生异常综合征、预防白细胞减少可能潜在的感染并发症等，目前市场上已经上市的G-CSF有非格司亭（Filgrastim）、培非格司亭（Pegfilgrastim）、利培非格司（Lipegfilgrastim）以及非格司亭生物仿制药，下图具体展示了非格司亭迭代产品的发展历史。
1. 非格司亭篇
非格司亭（Filgrastim）是应用重组DNA技术生产的甲硫氨酸人粒细胞集落刺激因子，包含175个氨基酸残基，其氨基酸序列与人的DNA序列预测的天然序列相同，仅仅是在N端插入了甲硫氨酸。非格司亭由Amgen和日本协和发酵麒麟株式会社（Kyawa Hakko Kirin）共同研发。1991年2月20日获得美国FDA批准上市，商品名为Neupogen?，1991年10月4日获得获得日本PMDA批准上市，商品名为Gran?。
1.1 非格司亭核心专利
非格司亭的核心专利最早在美国于1985年提交申请，专利号为US4810643A，1986年提交了国际申请，分别进入了欧洲、日本、中国等药品主流市场并获得授权。截至2006年，非格司亭的核心专利在上述国家已经全部届满失效，详见表1。
该项专利的独立权利要求保护的是一种纯化和分离的多肽，该多肽具有天然存在的粒细胞集落刺激因子的部分或全部的一级构象，我们都知道如果权利要求这样撰写，那么将不会授予专利权，原因是这仅仅是一种科学发现，是自然界中已经客观存在的未知物质，该独立权利要求进一步限定其特征为：此多肽是一种外源DNA序列的原核生物或真核生物表达的产物。这样就成为了使用制备方法限定的产品专利，从而获得授权。
在中国，1985年开始实施专利法制度，然而当时对于“药品和用化学方法获得的物质”还不能授予专利权，因此非格司亭的核心专利在中国的授权版本CN1020924C只能通过多肽的制备方法来保护。
1.2 非格司亭国际专利申请布局
为了实现盈利最大化，Amgen在研发早期就进行了专利布局，分别从G-CSF全基因核酸序列，氨基酸序列、各种氨基酸位点突变产生的新序列，各种化学修饰和类似物等方面进行保护。同时在外围针对序列改变所带来的适应症及联合用药也进行了专利布局，见表2。
随着非格司亭核心专利的到期，其仿制药市场的竞争也日益激烈，目前为止已有多家公司仿制非格司亭，见表3。截止2016年7月，EMA共批准9个非格司亭生物仿制药，其中Filgrastim ratiopharm已经撤市。而FDA批准的非格司亭生物仿制药仅有两个，包括Teva 公司Granix? （tbo-filgrastim）和Sandoz公司的Zarxio? （filgrastim sndz）。
FDA批准Teva公司的tbo-filgrastim(tbo-粒细胞集落刺激因子，又名XM02-filgrastim)于2012年8月29日上市，商品名为Granix，该药为监管部门批准的首个重组filgrastim生物仿制药。FDA 发言人谈到，'tbo'前缀并没有具体含义，只是FDA为了将梯瓦公司的产品与Neupogen进行区别而要求加上的。然而根据与Amgen达成的和解协议，Teva在2013年11月后才能在美国市场推出tbo-filgrastim。
另一个被FDA批准上市的非格司亭生物仿制药为瑞士制药巨头诺华（Novartis）旗下Sandoz的Zarxio?（filgrastim-sndz），于2015年3月6日获批。该药是通过美国《生物制品价格竞争与创新法案》（BPCIA）创建的新的生物仿制药途径批准的首个生物仿制药，是美国有史以来第一个真正意义上的生物仿制药。
FDA批准了Zarxio用于原研药Neupogen（filgrastim）所有5个适应症，但没有批准其与Neupoten的可互换性（interchangeability），这也意味着不可用Zarxio替代原研药Neupogen。价格方面，诺华将Zarxio定价较原研药Neupogen低15%，未来Zarxio究竟能达到怎样的高度以及市场接纳速度如何，仍有待观察。
2. 培非格司亭篇
培非格司亭（Pegfilgrastim）是Amgen公司开发的非格司亭的长效剂型，通过对粒细胞集落刺激因子（G-CSF）进行聚乙二醇（PEG）修饰，延长在体内的代谢时间，从而达到更好的疗效，临床上主要用于减少化疗相关的中性粒细胞减少症发生率，一个化疗周期中只需给药1次。
培非格司亭于2001年1月31日首次获得美国FDA批准，2002年8月22日获得EMA批准，商品名Neulasta?和Ristempa?，2014年9月26日获得PMDA批准上市。Amgen在美国和欧洲市场销售，日本协和发酵麒麟株式会社在日本市场销售。
2.1 非格司亭和培非格司亭的市场比较
2.2 培非格司亭设计思路（来源于专利信息）
非格司亭具有短期药物效果且对于粒细胞减少症的治疗需要坚持每天使用，这给患者和医疗人员带来了极大的负担，为了避免重复注射非格司亭带来的弊端，所以我们需要从两个方面考虑其修饰问题，一个是药物的缓释性，例如延长药物的释放时间，另一个是从循环半衰期方面，具有较长半衰期的分子将有效缓解粒细胞减少症并防止随后感染的必要给药，给患者带来极大的顺应性，因此，明确需要改进重组G-CSF分子。
聚乙二醇（PEG）是中性、无毒、无免疫原性、有良好的生物相容性的高分子聚合物，偶联到蛋白分子表面（PEG化），可改变其生物分配行为和溶解性，产生空间屏蔽，减少药物的酶解，避免在肾脏的代谢中被快速消除，并且可以降低或者消除诱导产生中和抗体和与抗体结合的能力，因而被广泛用于药物的修饰。
将上述思路结合起来，对非格司亭进行聚乙二醇化（Pegylated），即产生了非格司亭的长效型培非格司亭，如下图所示：
2.3 培非格司亭核心专利
培非格司亭的核心专利于1989年以国际专利申请，即PCT申请提交（公开号WO9006952A1），进入了大部分药品主流市场，并陆续在欧洲、美国、日本获得授权。美国专利US5824778A由于专利补偿制度，专利到期日为2015年10月20日。而欧洲和日本的专利权早在2009年就已经到期。值得注意的是培非格司亭的核心专利并没有进入中国。
该专利独立权利要求保护了“至少一分子聚乙二醇（PEG）偶联的具有生物活性的G-CSF”。说明书中重点介绍了培非格司亭的合成方法，采用定点修饰，修饰的位点是蛋白中第1位半胱氨酸的α-氨基和赖氨酸侧链氨基，而PEG采用直链型。
2.4 培非格司亭生物仿制药遭拒绝
培非格司亭这块如此巨大的蛋糕，其仿制药市场的动向又是如何呢？
非格司亭的仿制药虽然负担着“FDA批准的首个生物仿制药”的美誉，但其市场空间却很有限，所以Sandoz，做为一家非常有经验的生物仿制药开发商想借着Zarxio上市的契机冲击Neulasta这个“重磅炸弹”药物。
2015年11月，FDA接受了Sandoz的仿制药申请，预订审查期为10个月，也就是今年的9月份。但一条令人意外的消息打破了所有原定计划，2016年7月19日，诺华的第二季度财务报表中披露FDA拒绝了Sandoz的Neulasta生物仿制药的上市申请。
具体哪些方面出了问题，我们还不得而知，看来生物仿制药会涉及很多很复杂的问题，而这也正是许多仿制药企业需要克服和解决的。
3. 利培非格司亭篇
利培非格司亭（Lipegfilgrastim）是一种新颖的、聚乙二醇化、糖基化的长效型非格司亭，最初由Neose Technology公司（主要研究领域为糖基化）研发，随后Ratiopharm Group获得其开发权，2010年Teva将其收购并最终将利培非格司亭收入囊中，利培非格司亭于2013年7月25日获得EMA批准上市，商品名为Lonquex?。利培非格司亭将成为Amgen非格司亭（Fligrastim）和培非格司亭（Pegfilgrastim）强有力的竞争对手。
3.1 利培非格司亭设计思路
上面讲到培非格司亭的PEG及其衍生物连接肽的主要模式是通过氨基酸残基的非特异性结合。连接PEG和肽的另一种模式是通过糖肽上糖基的非特异性氧化，当然这种非特异性的方式将PEG添加至肽的主链上具有一定缺陷，包括缺乏成品的均一性以及降低多肽的生物活性等，因此如何能产生定点修饰，产品均一的修饰产物成为技术难题。
酶的合成技术具有区域选择性和立体选择性的优势，通过糖基转移酶的作用可以将PEG修饰的糖直接转移至多肽的主链上，从而实现在体外生产特异性修饰的，均一的生物治疗剂。
利培非格司亭则是基于上述糖聚乙二醇化（GlycoPEGylation）技术产生的一种长效重组粒细胞集落刺激因子（G-CSF）。
3.2 利培非格司亭核心专利
利培非格司亭说明书中描述的结构为单链的甲氧基PEG通过Linker糖链（包括甘氨酸、N-乙酰基神经氨酸、N-乙酰基半乳糖胺）偶联的非格司亭。以该结构为基础我们查找到利培非格司亭的核心专利，其发明名称为“糖聚乙二醇化的粒细胞集落刺激因子”。
该专利于由Neose Technologies提出，于2004年12月3日以国际专利申请，即PCT申请提交（公开号WO2005055946A2），目前已经在日本、中国、欧洲获得授权，专利到期日为2024年。美国专利US20070254836A1处于公开状态。
该发明重点保护了聚乙二醇化糖基化修饰的粒细胞集落刺激因子的结构通式。
3.3 利培非格司亭制备方法
在专利CN1897812B的说明书中了解到利培非格司亭的制备方法，该发明提供了制备上述部分的PEG化G-CSF的方法，包括在糖基转移酶介导下将底物G-CSF与PEG-唾液酸供体反应后将PEG-唾液酸转移至G-CSF上。PEG唾液酸供体具有通式：
首先使用唾液酸酶从G-CSF糖肽中除去现有的唾液酸，因此暴露全部或大部分的潜在的半乳糖基，使用合适的唾液酸转移酶来添加修饰的唾液酸，流程图如图1所示：
其中Gal代表半乳糖基，SA代表唾液酸。
唾液酸供体的结构为CMP-SA-PEG，其制备流程图如下图2所示：
完美的药物设计离不开最终的结果展示，图3展示了该酶促糖聚乙二醇化的G-CSF与Neupogen、Neulasta的体内停留时间，从图中可以看出该衍生物与天然的G-CSF相比较显著提高了药物动力学特征。
图4比较了图3所示物质的活性，可以看出糖聚乙二醇化的G-CSF的药物活性与可购得的单一聚乙二醇化的非格司亭（Neulasta）大约相同。
4. 总结
综上所述G-CSF经历了三代的迭代产品，如下表6所示，从短效到长效，从产品的非均一到定点修饰的均一性产品，实现了生物修饰产品的安全可控。
Amgen公司在自身的产品优势上利用Pegylation进一步开发出长效产品，从而在G-CSF领域中独占鳌头。其他公司为了争夺市场，只有两条路可以选择，一条是仿制，一条是创新。
这里面值得一提的是Teva公司，我们都知道Teva公司以仿制药而闻名，例如非格司亭的仿制药tbo-filgrastim。但近些年在仿制药的基础上也加大了对创新药的研发力度。利培非格司亭即是仿创结合的产物，巧妙的利用糖聚乙二醇化（GlycoPEGylation）避开Amgen公司培非格司亭的专利，从而提前抢占市场，成为Amgen非格司亭（Fligrastim）和培非格司亭（Pegfilgrastim）强有力的竞争对手。
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