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发酵饲料中的菌体种类繁多,大小各异,快速测定饲料中的细菌总数一直是一个难题。国标中规定的稀释平板菌落计数法步骤繁琐、误差大、耗时较长;而比浊法、电阻抗法、酶联免疫法、酶促生物发光法等又存在成本高、误差大、精密度低等问题;能够快速直接测定菌体数量的血球计数板法由于设计原因容易导致油镜难以聚焦,因此不适于测定体型较小的细菌,所以需要根据饲料样品的特殊性开发新的细菌总数测定方法。为了实现对发酵饲料中多种复合菌体细菌总数的快速测定,同时提高精密度、降低成本,本研究依据血球计数板的原理,结合革兰氏染色和显微镜检,利用统计学方法,构建了一种涂片显微计数法,并利用国标法对测定结果进行了验证。 1 .1 实验材料 快速革兰氏染色液,由温州市康泰生物科技有限公司提供,试剂盒组成R1:结晶紫染液,R2:革兰氏碘液,R3:脱色液,R4:复染液。 EM 菌(Effective Microorganisms,EM),由河南农富康生物科技有限责任公司提供,每克含5×1010 个有效活菌。 活化培养基:2.0 %葡萄糖、1.0 %蛋白胨、0.05 %硫酸镁、0.2 %磷酸二氢钾、0.05 %酵母浸膏、0.003 %硫酸铁、0.1 %氯化钠,pH 值7.2。 1.2 实验仪器 生物显微镜,奥林巴斯(深圳)工业有限公司,CX 21 型。 匀质器,江苏金坛市科学仪器厂,SK-1 型。 立式压力蒸汽灭菌锅,上海博迅实业有限公司,BXM-30R 型。 超净工作台,上海博讯实业有限公司,HJ-CJ-2D 型。 单道连续可调移液器,大龙兴创实验仪器(北京)有限公司,TopPette 型。 1.3 样品测定过程 (1)发酵饲料的制备 将EM 菌在无菌条件下接种于活化培养基中,35 ℃、180 r/min 下培养24 h 进行活化。将活化的EM菌接种于发酵饲料的原料中,35 ℃下需氧发酵72 h。 (2)试样的梯度稀释 无菌条件下称取试样10 g,转入含有90 mL、0.85 %生理盐水的三角瓶(三角瓶中含有适量的玻璃珠),置于匀质器上,8 000 r/min 处理1 min,经充分混匀后,即可获得10-1 的稀释液。重复上述操作,进行10 倍梯度稀释,依次获得等梯度稀释液。 (3)涂片染色 将盖玻片置于载玻片中央位置,用玻璃刀沿其四周轻轻划出24 mm × 24 mm 的矩形加样区(注意划线不要留有过深痕迹,避免因毛细作用对加样后样品悬液的均匀分散产生影响)。选择10-2 ～10-3 的稀释度,分别移取5 μL 试样稀释液和20 μL 灭菌生理盐水加于洁净、灭菌的加样区,混合均匀后涂布于整个加样区,每个稀释度作3 个平行。试样风干后进行革兰氏染色,然后用油镜进行显微镜镜检。 (4)显微计数 显微镜能够观察到的圆形区域叫做实际视场,也称视野,以FOV 表示,由公式(1)和公式(2)可分别求出其直径φ 和面积s 。依据随机区组设计的局部控制原则,在矩形加样区的左上、左下、右上、右下和中央区域进行分区,每个区域再各取5 个视野,即5 × 5 共测定25 个视野,对25 个视野进行计数并算出平均值 y ,然后按公式(3)即可计算出每g(mL)试样中所含的细菌总数T 。计数完毕后,取下盖玻片,用洗涤剂和清水将载玻片洗净,放入95 %乙醇中保存。为了保证计数的准确性,避免重复计数和漏计,在计数时,如菌体位于视野的边界处,则数上半圆不数下半圆。对于出芽的酵母菌,芽体达到母细胞大小一半时,即可作为2 个菌体计算。1实验
其中:
φ — FOV 的直径,单位:毫米(mm);
FN — 视场数,是指以毫米为单位限定试样成像范围的目镜光阑直径,(本例中为20 mm);
X — 物镜的倍率(本例中为100);
s — FOV 的面积,单位:平方毫米(mm2 );
T — 试样中的细菌总数,单位:个/克(毫升);
y — 25 个视野计数的平均值,单位:个;
d — 稀释度,待测试样的稀释倍数。
S — 加样区面积,单位:平方毫米(mm2 );
V — 菌悬液体积,单位:微升(μL);
(5)细菌总数的报告
每一稀释度使用3 个涂片的平均数,3 个涂片所得数值相互间存在1 个及以上数量级的误差,则不宜采用该稀释度的涂片计数。
选择25 个视野平均数在10～100 之间的涂片作为细菌总数的测定标准,按公式(3)报告之。若2 个稀释度的视野平均数均在10～100 之间,则按公式(3)分别计算出细菌总数,然后视两者之比来决定如何报告,若其比值小于或等于2,报告其平均数;若大于2 则报告其中较小的。若2 个稀释度的视野平均数均不在10～100 之间,则以最接近10 或100 的视野平均数,按公式(3)报告之。若2 个稀释度的视野平均数均远远大于100,则应取更高稀释度的样品进行测试,直至视野平均数为10～100 之间后,按公式(3)报告之。若2 个稀释度的平均细菌总数均远远小于10,则应取较低稀释度的样品进行测试,直至视野平均数为10～100 之间后,按公式(3)报告之。
报告试样中的细菌总数时,采用3 位有效数字乘以10 的指数次方的形式来表示,3 位有效数字后的数值以四舍五入的方式取舍。
1.4 生理盐水体积的选择
按照1.3 中(3)的方法进行制样。移取10-2稀释度的稀释液5 μL,滴于载玻片中央24 mm ×24 mm 的加样区,然后设计迭代实验,从250 μL 开始,分别加入不同体积的灭菌生理盐水,利用牙签将混合液均匀涂布于整个加样区,观察混合液在加样区的涂布情况,并以此判断最佳的生理盐水体积,平行测定3 次,观察结果。
1.5 菌悬液稀释度的选择
移取10-1 ～10-5 稀释度的菌悬液各5 μL,分别与20 μL 灭菌生理盐水均匀混合于24 mm × 24 mm 的加样区,涂片、风干、染色后,按照随机区组设计的5 × 5 视野分布,利用1.3 中的方法,平行3 次测定相同发酵条件的饲料中的细菌总数。
1.6 视野分布的选择
依据随机区组设计的局部控制原则,设定4 × 4,4 × 5,5 × 4,5 × 5,9 × 4,9 × 5 共6 组不同的视野分布,示意图如图1。利用1.3 中方法,平行3 次测定相同发酵条件的饲料中细菌总数。
注:每个网格图均为大小为24 mm × 24 mm 的矩形加样区,每小格边长为1 mm。图中黑点为视野位置。
1 .7 实际样品的测定和验证试验
随机抽取3 种不同发酵条件的饲料样品,分别用涂片显微计数法和国标GB-T 13093-2006 《饲料中细菌总数的测定》中方法,测定样品中的细菌总数。每个样品平行测定5 次,分析涂片显微计数法的精密度和重现性,并根据实验结果比较两种方法的显著性差异水平。
2.1 生理盐水体积的确定
生理盐水的体积直接影响涂层的厚度和菌悬液的涂布情况,体积过大,则混合液涂层过厚,风干时间太久,延长了测定时间,甚至还会溢出加样区域,影响测定的准确度;而如果体积过小,则有可能无法使菌悬液完全覆盖整个加样区域,同样也会影响测定的准确度。表1 是迭代实验中加入不同体积灭菌生理盐水后在加样区域的涂布情况。从表1 可知,当生理盐水体积为20 μL 时,菌体悬液可以涂布整个加样区,没有可见溢出或者无法涂满整个加样区的现象,故选择20 μL 的生理盐水较为适宜。每组待测样品平行重复3 次,观察结果一致。根据计算,生理盐水和菌悬液的总体积为25 μL,均匀涂布于加样区后的试样厚度约为43μm,比较利于稀释液中的细菌分散成单层,方便后续观察和检测计数,而且涂层很薄,利于试样的风干。
2.2 菌悬液稀释度的确定
利用不同稀释度的菌悬液测定细菌总数时视野中的菌体数见表2。由表2 可知,当稀释度为10-1 时,菌体浓度过高,加样区细菌菌体堆积,不能单层分散开,视野中的细菌平均数(MN )过多;当稀释度为10-3 及以上时,稀释度过高,稀释液中菌体太少,镜检计数误差较大,实验结果不准确;当稀释度为10-2 时,菌体能够均匀分散成单层,数量适中,易于观察,便于计数,且误差较低。因此,在本例中,选择10-2 为适宜的稀释度。需要指出的是,涂片显微计数法适用于单位质量(或体积)细菌总数相对较多的试样(一般至少为108 个/g)。而发酵饲料常以EM 菌、乳酸菌、酵母菌、芽孢杆菌等厌氧或兼性厌氧菌进行固态发酵,在人为控制条件下,因其生长所需营养条件简单,易形成优势群落,且随着发酵时间的延长,益生菌的数量也会随之增加,所以为了提高本方法的普适性,综合考虑,一般选择10-2～10-3 2 个稀释度进行发酵饲料中细菌总数的测定较为适宜。
根据1.3 中细菌总数的报告规则,选择10-2 的细菌平均数较为合适,由公式(3)计算可得,发酵饲料样品中的细菌总数为1.38 × 1010 个/g。
2.3 视野分布的确定
依据随机区组设计原则设定的6 种不同视野分布测定的视野中细菌的平均数量见表3。由表3 可知,随机区组设计为4 × 4,4 × 5 时,分散不均匀,区组数少,不具有组内同质性,标准差(SD )大,误差较大,不能代表加样区内的整体细菌分布。随机区组设计为9 × 4,9 × 5 时,能够完全代表加样区细菌总数,但区组数增多,处理量过大,局部控制的效率降低。综合考虑,当随机区组设计为5 × 5 时,既能够代表加样区整体的细菌分布,标准差较小,而且数据处理量适中,因此,选择5 × 5 随机区组设计,25 个视野数进行显微计数较为适宜。
2.4 方法的重现性和准确度
为了考察涂片显微计数法检测结果的重现性、可靠性,分别测定了3 种不同发酵条件的饲料样品中的细菌总数,各平行测定5 次,结果见表4。从表4 可以看出,4 种饲料中细菌总数测定的变异系数(C.V./%)均低于15 %,说明试样间的测定结果无明显差异,方法的重现性较好。与之相比,国标法测定的误差较大,而且步骤繁琐,耗时较长。
国标法测定上述3 种饲料中的细菌总数结果也列于表4 中。分别对表4 中2 种方法所得的3 组数据进行配对t 检验,结果均为p >0.05,表明本研究所建立的涂片显微计数法与国标中的稀释平板菌落计数法不存在显著性差异,可以用于发酵饲料中细菌总数的测定。
图2(a)为饲料A 第1 组中央区域中央视野的镜检图(图中暗灰色斑点与图中阳性菌、阴性菌不在同一焦距平面,是载玻片和物镜上的杂质),视野中共出现22 个革兰氏阳性菌(蓝圈标记)和2 个革兰氏阴性菌(红圈标记)。经革兰氏染色,可以清晰分辨革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌,还可简单观察细菌的形态,通过比对标准图样,对细菌的鉴定、分离、纯化等后续操作具有一定指导意义。此外,由图2(a)可知,EM 菌经发酵后,微小细菌占据优势地位,图中可见最小革兰氏阳性菌,经测算直径为1 μm 左右,相比于血球计数板法,涂片显微计数法可以提高微小细菌的检出率,提高测定结果的精确度。图2(b)为产朊假丝酵母菌革兰氏染色后的镜检图(也可用美蓝染色法),视野中菌体形态清晰,均匀分散,说明本方法在测定多种复合菌种时,还可对常见的酵母菌进行计数,并为其鉴定提供依据。
(1)研究设计了一种涂片显微计数法,用于发酵饲料中细菌总数的测定。该方法将一定量适当稀释的试样涂布于载玻片上特定的加样区,经革兰氏染色后直接用油镜对选定区域内各个视野中的菌体进行计数,最后根据公式推算试样中的细菌总数。
(2)涂片显微计数法具有较高的重现性,且与国标法测得的数据基本一致,但与国标方法相比,可以减小测定误差,经革兰氏染色,还可以简单鉴定细菌的形态与类型。
(3)由于利用油镜进行观察,可以直接、实时、快速测定较小的细菌。该方法操作方便、成本低廉、精密度高,无需标准浓度的菌液作对比,通过镜检还可以排除杂质的干扰,适于测定高浓度、含多种复合菌体的饲料样品中的细菌总数。
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责编：马维军；审阅：陈达
（来源：华北理工大学学报；作者：张伟,王巍杰 ,张小乐）
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