慢性肾脏病矿物质与骨异常（CKD-MBD）研究新进展(基础篇)
壹
近年来血管钙化机制研究进展
血管钙化是维持性血液透析（MHD）患者的主要并发症，而血管壁中层的血管平滑肌钙化(VSMC)是晚期慢性肾脏疾病患者的独特而突出的特征，目前被认为是MHD患者心血管和全因死亡的重要预测因子和独立危险因素。VSMC活跃的成骨过程，受到细胞内成骨分化和细胞外基质（ECM）重塑等多方面机制的调控，包括遗传、细胞微环境和细胞信号调节因子。研究显示血管壁显著的异位钙化经常伴随骨密度的降低或骨代谢紊乱。深入探讨慢性肾脏病矿物质及骨代谢疾病（CKD-MBD）中血管钙化的调控机制，及其与骨矿化的联系，是未来CKD-MBD领域研究的热点问题。
01
血管钙化与骨代谢异常密不可分
已有多项研究报道了低骨密度(BMD)与血管钙化(VC)之间的关系。该课题组首创开发了一种使用同基因主动脉移植(ATX)的新动物模型。将严重钙化的尿毒症大鼠主动脉移植到健康大鼠(尿毒症ATX)。将正常主动脉移植到健康大鼠(正常ATX)和年龄匹配的大鼠中作为对照组。尿毒症大鼠的骨小梁组织密度，与两个对照组相比显著降低。尿毒症ATX大鼠骨骼中矿化抑制剂骨桥蛋白和进行性强直蛋白同源物显着上调。此外，研究还发现尿毒症ATX大鼠骨组织中与细胞外基质、骨转换和Wnt信号相关的几个基因的mRNA水平发生了显著变化，而正常ATX大鼠与对照组之间无明显差异。骨组织形态计量学分析显示，尿毒症ATX组与正常ATX组相比，类骨质面积显着降低，同时在糜烂陷窝中有成骨细胞减少和破骨细胞增多的趋势。尿毒症ATX与正常ATX的骨小梁数目和厚度相似。三组间骨形成率无明显差异。三组患者的血浆生化指标，包括硬化素、肾脏和矿物质参数均相似。体外培养的尿毒症大鼠主动脉可高分泌Wnt抑制剂硬化素。该研究发现VC的存在会降低了骨密度，破坏骨代谢，证明了血管系统与骨组织之间存在相互影响。
02
钙离子与醛固酮通过AIF-1/NF-B途径参与尿毒症VSMC的炎症、凋亡和钙化
钙和醛固酮通过同种异体移植物炎症因子1(AIF-1)途径的相互作用促进了钙稳态和VSMC钙化，这是尿毒症血管钙化的一种新机制。结果表明，钙化动脉中醛固酮和炎症因子水平升高，而外周血中醛固酮和炎症因子水平无明显变化。而未发生主动脉钙化的尿毒症大鼠外周血中炎症因子的表达明显增加，随着主动脉钙化程度的加重，炎症因子的表达逐渐恢复到正常水平。结果表明，在巨噬细胞或VSMC中，钙离子与醛固酮之间存在相互作用。钙可诱导醛固酮的合成，而醛固酮又可引起巨噬细胞或血管平滑肌细胞内钙含量的上调。此外，活化的巨噬细胞可诱导VSMC的炎症、凋亡和钙化。激活的VSMC对未处理的VSMC也有类似的作用。最后，AIF-1促进醛固酮或钙诱导的VSMC钙化，NF-B抑制剂抑制AIF-1对VSMC的作用。这些结果提示钙离子与醛固酮之间的串扰通过AIF-1/NF-B途径在尿毒症VSMC钙化中起重要作用。局部钙化的VSMC引起周围VSMC同样的病理过程，从而促进钙稳态，加速血管钙化。
03
生物钟在甲状旁腺运作，并干扰慢性肾脏疾病相关的骨骼和矿物质代谢
新陈代谢、激素分泌、细胞周期和运动活动的昼夜节律是由分子生物钟调节的，其主钟位于中枢神经系统的视交叉上核，然而体内的分子生物钟也在几个外周组织中表达。虽然大约10%的基因是由时钟机制调节的，但甲状旁腺内部的分子生物钟之前还没有被研究过。甲状旁腺激素的分泌具有明显的昼夜变化，甲状旁腺激素基因启动子含有一个类似E-box的元件，E-box元件是已知的核心昼夜节律钟蛋白BMAL1和clock的靶点。因此作者研究了甲状旁腺内部的分子生物钟，考虑到在一些外周组织中，生物钟主要是由进食而不是视网膜的光输入所驱动的，因此研究了甲状旁腺内部的分子生物钟是否受到进食的影响，并探讨了它在慢性肾脏疾病中可能发挥的作用。由于尿毒症与甲状旁腺的高度增生相关，而昼夜节律紊乱与异常生长有关，作者检测了甲状旁腺时钟和时钟调控的细胞周期基因在正常和尿毒症大鼠甲状旁腺中的表达。研究发现，生物钟基因在正常甲状旁腺中有节律地表达，且与其他一些周围组织相比，进食对甲状旁腺生物钟的影响最小。接着检测了甲状旁腺增殖和甲状旁腺激素分泌的调节因子的表达，发现成纤维细胞生长因子受体1、MafB和Gata3有明显的节律性。在尿毒症大鼠的甲状旁腺和主动脉中，生物钟基因和细胞周期调节因子Cyclin D1、c-Myc、Wee1和p27的表达脱离了生物钟的调控，其昼夜节律紊乱。因此，在甲状旁腺中存在工作的分子生物钟，在尿毒症中该生物钟和下游的细胞周期调节因子受到干扰，可能导致继发性甲状旁腺功能亢进症的甲状旁腺增生失调。
贰
未来治疗的靶点探索
01
TDAG51是血管钙化的关键调节因子
TDAG51(T细胞死亡相关基因51)及其人类同源基因PHLDA1(Pleckstrin Homology-like domain，A家族，成员1)是Pleck-strin同源结构域基因家族的成员，传统上被认为是能够导致多种哺乳动物细胞凋亡的肿瘤抑制基因。该研究发现TDAG51在Pi诱导的血管平滑肌细胞中的表达，并在钙化的人体血管的中层表达。此外，还发现TDAG51-/-VSMC表达Pit-1的水平降低，且该基因敲除小鼠还观察到中膜血管钙化的显著减弱。TDAG51可能是预防慢性肾脏疾病患者VC和心血管疾病的治疗靶点。
02
EOS789-泛磷酸盐转运蛋白抑制剂，改善血管钙化
口服磷酸盐结合剂用于治疗高磷血症，但许多患者会出现胃肠道副作用。EOS789是一种泛磷酸盐转运蛋白抑制剂，它能抑制肠道对磷酸盐的吸收，其作用机制与磷酸盐结合剂不同。它可以与几种钠依赖的磷酸盐转运体(NaPi-IIb, PiT-1, and PiT-2)相互作用，已知这些转运体有助于肠道吸收磷酸盐。该抑制剂剂量依赖性地增加了正常大鼠粪便磷排泄率，表明其抑制了肠道磷吸收。在腺嘌呤诱导的高磷血症大鼠中，EOS789显著降低血清磷酸盐、FGF23和全段甲状旁腺激素水平。在高磷血症大鼠中，这种泛磷酸转运蛋白抑制剂比NaPi-IIb选择性抑制剂对血清磷酸盐的作用更强，这表明PiT-1和PiT-2在肠内磷酸盐吸收中发挥重要作用。该研究还发现EOS789不仅降低血清磷的的水平，还能够改善胸主动脉异位钙化。
03
CKD-MBD小鼠模型中，抑制组织非特异性碱性磷酸酶可防止动脉钙化
主动脉过表达组织非特异性碱性磷酸酶(TNAP)会加速血管钙化的形成。SBI-425是一种有效的、选择性的、口服生物利用率高的化合物，能在体内有力地抑制TNAP。既往研究发现C57BL/6J小鼠对异位钙化有很好的耐受性，该研究建议了一种新的CKD-MBD小鼠模型，显示出高磷血症和继发性甲状旁腺功能亢进症，模拟了CKD患者的动脉中层钙化和肾性骨营养不良等相关并发症。将CKD-MBD小鼠分为三组:对照组、SBI-10和SBI-30组。14～20周龄时饲喂0.2%腺嘌呤和0.8%磷诱发慢性肾病，随后饲喂0.2%腺嘌呤和1.8%磷6周。在14～ 20周龄时，SBI-10和SBI-30组小鼠分别灌胃10 mg/kg和30 mg/kg SBI-425，每天1次;对照组小鼠在8-20周龄期间喂食标准饲料(0.8%磷)。CT成像、组织学和主动脉组织钙含量显示，与对照动物相比，SBI-425几乎停止了MAC的形成。正常饮食组、SBI-10和SBI-30组小鼠的存活率为100%，明显优于对照组（57.1%）。SBI-425抑制编码TNAP的主动脉Alpl mRNA表达，抑制血浆和主动脉组织TNAP活性，而升高血浆焦磷酸盐。TNAP抑制剂SBI-425成功地保护了血管系统免受MAC的影响，并提高CKD-MBD小鼠模型的存活率，而不会对正常骨骼形成和残余肾功能造成不利影响。由于MAC是预后不良的危险因素，高磷血症与晚期CKD患者MAC并发症密切相关，SBI-425有望通过抑制MAC的形成，改善预后。
04
组织工程学架起血管钙化机制研究的桥梁
多能间充质祖细胞在未分化或分化为平滑肌细胞后培养成管状血管组织，并通过靶向基因分析研究异位钙化。来自分化和未分化细胞的组织因高磷酸盐无机磷(Pi)处理而钙化，这表明单一细胞类型(祖细胞或分化细胞)可能不是这一过程的唯一原因。该研究还证明作为基质玻璃蛋白激活剂的维生素K对工程化血管组织中的钙化有保护作用。这种组织工程模型是研究疾病和潜在治疗策略的有效工具。
我们已经开始认识到骨和血管细胞具有相似的成骨分化和矿化过程，以及它们对微环境变化的截然相反的反应和结果。然而到目前为止，还没有有效的选择性治疗方法来治疗血管钙化。从人类和动物模型中发现他汀类药物、ACE抑制剂、AGE交联剂、磷酸盐结合剂或焦磷酸盐类似物，在血管钙化和动脉硬化方面显示出有益的效果，而其中一些治疗方法也显示出对骨密度的积极影响。由于骨和血管细胞具有相似的矿化过程，血管钙化的治疗策略不应忽视对骨的潜在影响，反之亦然。对衰老和血管钙化流行疾病中的血管和骨细胞进行系统比较的进一步研究可能揭示特定细胞类型的调节网络或特定于疾病的调节因子。揭示骨和血管细胞对全身和局部环境变化的内在细胞调控，将有助于确定可用于血管钙化治疗干预的精确靶点，而不会影响骨骼系统。
参考文献
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-The End-
文字：王静 万慧婷
编辑：金鑫 潘艳艳【江苏省人民医院肾内科】
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