HPLC最全解析：绝对实用。。。

高效液相色谱法：以气相色谱为基础，在经典液相色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法。。。

HPLC与经典LC区别

主要区别：

固定相差别，输液设备和检测手段。

1.LC：仅作为一种分离手段；

①柱内径1~3cm，固定相粒径>100μm且不均匀；

②常压输送流动相；

③柱效低（H↑，n↓）；

④分析周期长；

⑤无法在线检测；

2.HPLC：分离和分析；

①柱内径2~6mm，固定相粒径<>

②高压输送流动相；

③柱效高（H↓，n↑）；

④分析时间大大缩短；    

⑤可以在线检测；

HPLC与GC差别

相同：

兼具分离和分析功能，均可以在线检测；

主要差别：

分析对象的差别和流动相的差别；

1.分析对象

GC：

①能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品；

②高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品不可检测，占有机物的20%；

HPLC：

①溶解后能制成溶液的样品；

②不受样品挥发性和热稳定性的限制；

③分子量大、难气化、热稳定性差及高分子；

④和离子型样品均可检测；

⑤用途广泛，占有机物的80%；

2.流动相差别

GC：

①流动相为惰性气体；

②组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用；

HPLC：

①流动相为液体；

②流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素，对分离起很大作用；

③流动相种类较多，选择余地广；

④流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用；

⑤选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相；

⑥可以增大分离选择性；

3.操作条件差别

GC：

加温操作；

HPLC：

①室温；

②高压；（粘度大，峰展宽小）

HPLC法中分离条件的选择

1.固定相与装柱方法的选择：

选粒径小的、分布均匀的球形固定相（dp≤10μm）；

首选化学键合相，匀浆法装柱；

2.流动相及其流速的选择：

选粘度小、低流速的流动相—甲醇，1mL/min；

3.柱温的选择：

选室温25℃左右；

各类高效液相色谱法 

(一)液固吸附色谱法（LSC）      

 流动相为液体，固定相为固体吸附剂；
1．分离机制：

利用溶质分子占据固定相表面吸附活性中心能力差异； 
分离前提：

K不等或k不等；
2．固定相：

与LC比，固定相粒径不同（<>）； 
3．流动相：

底剂（烷烃）+有机极性调节剂；   
※例：正己烷或庚烷+氯仿。。。
4．影响K的因素：

与固定相性质和流动相性质有关；
溶质分子极性↑，洗脱能力↓，k↑，t_R↑；
溶剂系统极性↑，洗脱能力↑，k↓，t_R↓；
注：调节溶剂极性，可以控制组分的保留时间；
5．出柱顺序：

强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱；
6．硅胶吸水量↑，LSC→LLC
硅胶含水量较小，吸附色谱，硅胶极性较大；
硅胶含水量>17% ，分配色谱，硅胶失活→载体；
吸附的水→固定液
(二)液-液分配色谱法（LLC）
1．分离机制：

利用组分在两相中溶解度的差异
2．固定相：

载体+固定液（物理或机械涂渍法）
缺点：

系统内部压力大，易流失，不实用
固定液-极性→NLLC

固定液-非极性→RLLC
3.①正相色谱-固定液极性>流动相极性（NLLC）
极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱：适于分离极性组分；
②反相色谱-固定液极性流动相极性（RLLC）

极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱：适于分离非极性组分；
(三)化学键合相色谱法（BPC）
1.化学键合相 
（1）分离机制：

分配+吸附（以LLC为基础）；
（2）特点：
 1）不易流失；
 2）热稳定性好；
 3）化学性能好；
 4）载样量大；
 5）适于梯度洗脱；
2.反相键合相色谱
（1）分离机制：

疏溶剂理论； 
正相-流动相与溶质排斥力强，作用时间↑，K↑，组分t_R↑；
反相-流动相与溶质排斥力弱，作用时间↓，K↓，组分t_R↓；
（2）固定相：

极性小的烷基键合相；
C₈柱，C₁₈柱（ODS柱-HPLC约80%问题）；
（3）流动相：

极性大的甲醇-水或乙腈-水；
流动相极性>固定相极性；
底剂+有机调节剂（极性调节剂）；
例：水+甲醇，乙腈，THF；
（4）流动相极性与k的关系：

流动相极性↑，洗脱能力↓，k↑，组分t_R↑
（5）出柱顺序：

极性大的组分先出柱；

极性小的组分后出柱；
（6）适用：

非极性~中等极性组分（HPLC 80%问题）

3.正相键合相色谱
(1)分离机制：

溶质分子与固定相之间定向作用力、诱导力、或氢键作用力
(2)固定相：

极性大的氰基或氨基键合相；
(3)流动相：

极性小（同LSC）；底剂+有机极性调节剂； 
例：正己烷+氯仿-甲醇，氯仿-乙醇；
(4)流动相极性与K的关系：
流动相极性↑，洗脱能力↑，组分t_R↓，k↓；
(5)出柱顺序：

结构相近组分，极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱；
(6)适用：
氰基键合相与硅胶的柱选择性相似（极性稍小），分离物质也相似；
氨基键合相与硅胶性质差别大，碱性，分析极性大物质、糖类等；
4.离子对色谱和离子抑制色谱
反相离子对色谱法（IPC或PIC） 
反相色谱中，在极性流动相中加入离子对试剂，使被测组分与其中的反离子形成中性离子对，增加K和t_R，以改善分离；
(1)离子对试剂：

烷基磺酸钠→分析碱
四丁基季胺盐→分析酸
(2)影响K的因素:
a．与m的极性有关（同反相色谱）；
b．与R的链长有关：R↑长，极性↓小，t_R↑，k↑；
(3)适用：

较强的有机酸、碱；

反相离子抑制色谱；
在反相色谱中，通过加入缓冲溶液调节流动相pH值，抑制；
组分解离，增加其K和t_R，以达到改善分离目的；
1）离子抑制剂：

弱酸、弱碱性物质；

 pH一定的缓冲溶液；
2）K的影响因素：

与流动相极性有关，还与pH值有关；
选择流动相：

应同时考虑极性及pH值； 
酸性物质-加入酸H_Ac，t_R↑，K↑； 
碱性物质-加入碱NH₃·H₂O，t_R↑，K↑；  
调节pH范围：

3.0~8.0；
pH>8.0破坏键合相与载体的结合；
pH<>腐蚀柱子；
3）适用：

极弱酸碱物质；
pH=3~7弱酸；

pH=7~8弱碱；

两性化合物；

（文章改编自小木虫论坛）

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