作者丨Paul Nurse
编译 | 十一月
责编 | 兮
笔者按：全文大约6.4k字，阅读时间5-10分钟，希望大家能从Paul的故事中有一些自己的感悟和收获，这些Paul亲自记录的小故事和身处其中心态的波澜起伏可能也正是各位研究生与博士后正在经历的过程，与各位共勉。
原文：Nurse, P. (2016). Learning from the uncontrollable. Cell, 165(6), 1301-1306.
研究论文通常是修正主义的历史记录，由无可挑剔的逻辑驱动并且其中的实验也都是成功的，但是这绝不能反映实验室中真实生活的缓慢、混乱和偶然。但我想告诉你一些影响我早期职业生涯的发现以及背后真实的故事。
那是1974年，我只有25岁时，正在研究裂殖酵母的细胞周期的控制。受到来自Lee Hartwell的文章中对于芽殖酵母中细胞分裂周期（cdc）突变体的分离深刻启发，我开始在裂殖酵母中分离cdc突变体。这些突变体不能分裂，但仍然可以生长，因此形态上变得非常细长。对它们进行筛选是一项艰苦而缓慢的工作，只有万分之一的原始诱变细胞产生cdc突变体。因此，我花了一年的时间来确定足够的突变体来定义30个cdc基因（我们现在知道有400-500个细胞周期基因）。为了减少随机视觉筛查的繁琐工作量，我需要一个选择程序，因此我在突变后通过梯度离心细胞以富集扩增的细胞，然后在显微镜和微观下检查由这些细胞形成的菌落。然而，这并不是一个明智的想法，因为诱变损伤的DNA会阻止随后的有丝分裂的发生，导致细胞伸长可能不是由于特定的基因缺陷，而是由于非特异性DNA损伤，这会影响菌落中的许多细胞。我在这个过程中挣扎了几个星期，不幸的是，我想出的这种新方法的筛选速度甚至远慢于常规筛选步骤。在我发现一些意料之外的表型的那会儿，我已经差不多快要完全放弃这种方法。
它（意料之外的表型）是由小细胞组成的菌落，比正常的杆状野生型裂殖酵母细胞短。这是与我正在寻找的细长型细胞完全相反的表型。起初我有点恼火，然后我逐渐意识到这种尺寸比较小的细胞分裂速度可能比正常的更快。如果正确的话，这个小型突变体正在定义一种细胞周期控制原理。这是完全没有预见性、没有逻辑、完全的偶然，我只是不小心发现了大自然给我的东西。
这个第一个突变体，我称之为''wee''，因为它很小，而且是在苏格兰时分离出来的，而且该突变体是温度敏感的。这意味着它在低温下具有正常尺寸而在高温下很小。在与我的博后同事Peter Fantes讨论后，我们得出结论，通过改变温度，可以确定细胞周期中细胞何时进展，因此我们可以确定哪个步骤是限制细胞周期进展的时期。最终结果表明wee1作用于G2-M期，因此该基因决定G2的长度，从而确定有丝分裂的发生。这是一个惊喜，因为当时大多数研究人员认为限速细胞周期控制将在G1的细胞周期开始时发挥作用。我对这些结果很兴奋，并开始跟大家谈论这些结果。我怎么解释我做了什么？我必须很惭愧地说我写了修正主义色彩的记录。我说我的计划一开始就有一个很好的想法，想要找到小个儿的突变体，因为小突变体会揭示限速细胞周期控制，然后我英勇地投身小型突变体的筛选，导致最终发现我想象可能存在的突变体，最后用无可挑剔逻辑描述一切意味着什么。
事实上，我不过是偶然地被大自然突如其来的小意外闪到了腰所以发现了这个突变体。
我决定寻找更多的小个儿突变体来定义细胞周期的限速步骤和在这些控制中起作用的基因。因此，我先给自己设定了一个小目标，找到他 50个小个儿突变体的“小目标”。这种搜索比寻找cdc突变体更加繁琐，因为这些突变体更罕见。在第二年的大部分时间里，我一直在分离新的突变体，检查是否是wee1的等位基因，或者定义新基因。每周发现大约一两个新的突变体，但都是wee1的等位基因。我的进展甚微。在我令人沮丧的任务即将结束时，我发现了变种48，但遗憾的是它是在一个覆盖着丝状真菌的盘子上。我难以将酵母菌株从更快速扩散的污染真菌中纯化出来。在下午晚些时候这也是一个寒冷的苏格兰11月星期五，正在下雨。那周末我感到很累，并且确信这个突变体肯定又是wee1的另一个等位基因，它只能是将我的实验记录本上筛选到的wee1突变体从47个突变增加到48个。我把它扔在垃圾桶里然后回家了。
然后我感到内疚。万一这个突变体真的很特别怎么办？也许它定义了一些新的、不同的东西，而不是wee1的另一个等位基因。我吃完晚饭然后骑上自行车。天很黑，还在下雨，我骑车回到了实验室。翻找垃圾桶，我找到了那个板子并开始了将酵母从不断侵入的真菌中分离培养。最后，我得到了一个新的wee突变体，与我的wee1等位基因交叉，发现它是一个与wee1无关的新基因！我称之为wee2，当然听起来比wee1更愚蠢。
所以现在有两个参与细胞周期控制的基因wee1和wee2。这是没有PCR的20世纪70年代，因此唯一可能的实验方法必须利用经典遗传学。在50个小突变体中，49个是wee1的等位基因和wee2的1个等位基因。这表明wee1编码了G2至有丝分裂转换的抑制因子，因为功能丧失突变可能是常见的。鉴于仅分离出一个wee2突变，或许wee2编码一个激活因子，而wee2突变使该激活因子更活跃。这种正向作用的功能获得变化可能是罕见的。但这也意味着功能丧失的wee2突变将无法完成细胞周期。因此，可能已经分离的一种cdc突变定义了一种cdc基因，该基因可能被过度活化以产生wee2的表型。可能这种cdc基因已经被鉴定出来了。然而，这不太可能，因为鉴定的30个基因仅代表预期的总cdc基因的一小部分。所以这也许值得一试。
因此，我将wee2突变体与30个cdc基因中每一个的代表性等位基因杂交。我很幸运可以说是非常幸运。wee2与cdc2密切相关。我向我的同事一位遗传专家Pierre Thuriaux解释了所有这些，但他说wee2可能与cdc2不是同一个基因，而更可能是与cdc2基因位置非常相近。如何使用经典遗传学解决这个问题？唯一的方法是构建cdc2的精细结构图谱并将wee2突变等位基因映射到该图上。这是另一个非常缓慢的项目。必须找到新的cdc2等位基因并进行映射，必须确定连锁，必须制作精细的结构图，最后，wee2必须映射到cdc2基因图上。另一年过去了最终表明wee2等位基因确实在cdc2基因内定位。因此，wee1和cdc2充当负向和正向作用调节因子，在裂变酵母细胞周期的主要限速步骤中起作用，作用于G2-M的转变。
我对这个结果非常满意。但有一个问题。不幸的是，世界并没有像我对这个结果中那样感兴趣，因为大多数注意力仍集中在G1期的细胞周期控制。对我来说这是一个特别大的难题，因为到现在我有两个小孩和还有贷款，而我的博士后工作即将结束。我还在爱丁堡Mudison的实验室里工作，他非常支持我，但我没有长期工资，现在我有一个有两个孩子的家庭需要支撑。我在Mudison的实验室发表了大量论文，但他的名字并没有出现在我的论文之中，因为他说他没有亲自参与实验，他是“一位真正慷慨的科学绅士”。但是我必须找到一份工作，并且由于大家对于G2细胞周期控制缺乏兴趣，我认为我最好在G1期的调控上做一些工作。但我该怎么办？Lee Hartwell再一次挽救了我。他用他的萌芽酵母cdc突变体进行了巧妙的研究，揭示了一种名为“起始”的G1对照。他在细胞周期的不同阶段获得了cdc突变体。他称这种细胞周期控制的存在并定义了几个起始基因，其中一个被称为CDC28。
我认为我很容易在裂殖酵母中进行类似的分析，因此我可以为G1细胞周期控制作出贡献，尽管这种贡献可能是次要的。如果成功，也许我就可以找到一份工作。所以我建立了一个分析系统并且很快就取得了进展。大多数cdc突变体在它们未能接合的阶段被阻断，但我发现G1早期的一个阻断非常有效地接合。该突变体定义了cdc10编码转录因子，最终发现该转录因子负责DNA复制所需的基因产物的转录。该基因在细胞命运决定之前起作用，因此将起始的概念扩展到裂殖酵母。我在发表之前的最后一个实验是测试最好研究的cdc2突变体。这些突变体在G2中被阻断，因此将超过G1中的命运决定起始点。这是我的负对照。
但我的负对照不起作用。在限制性温度下被阻断的cdc2突变体仍然可以接合，而且概率大约20％-25％。我非常想忽略这个结果，但20％-25％的数字相当高。我怎么能解释这个明显不正确的结果？也许用于阻断cdc2突变体的水浴温度不正确。我发现，当实验不起作用时，生物学家常常责怪温度。所以我检查水浴，重复实验，再次获得25％的接合概率。我买了一个更大的温度计，检查水浴的温度，重复实验，再次得到25％。我感到沮丧，停止了一个月的实验，再次做了实验，仍然有25％。（笔者按：真的非常像在实验室的我们，所以祝福各位朋友们在遇到难题的时候多讨论多思考，也许那个不能解释的实验结果正是这个世界知识的边界）
我陷入了两难境地。其他一切都完美无缺。但25％的中间结果意味着什么？如果我在我的研究论文中报告了这个中间结果，我确信它会破坏其他结果的价值，并且会导致该论文被拒绝。那么关于我的工作，支付抵押贷款，喂养我的宝宝，我该怎么办？糟糕的想法开始进入我的脑海。也许我应该忘记cdc2的结果。这很容易做到，因为只有我知道他们，如果我这样做，那么也许我可以发表我的论文。
幸运的是，我很快意识到这是不可接受的。为什么我没有得到“正确”的结果，我不停地绞尽脑汁。然后我有了新的想法。如果25％实际上是正确的结果怎么办？我以前从没想过这个;我一直以为它一定是错的。所以如果25％是对的，怎么解释呢？
我是一名滑翔机飞行员，几天后，当我在爱丁堡周围的山上滑行时，我得到了一个可能的解释。我总是发现做一些像飞行这样完全不同的事情有助于形成新的想法，而不断思考同一个问题会扼杀真正新颖的方法。一旦去思考，它就显而易见了。如果在细胞周期中需要cdc2两次—如已经显示的那样在G2中进行有丝分裂，而且也在G1期发挥作用—那么可以解释25％的值。由于G1在裂殖酵母中很短，当大量的细胞被阻滞时，只有一小部分酵母细胞在G1中阻滞。目前，FACS可以对细胞进行分选，但那会儿流式分选仪还没有那么普遍。为了测试这种可能性，我在G1中捕获细胞并将它们释放到cdc2阻滞的过程中。令我感到宽慰的是，他们都在G1中被阻挡并且可以非常有效地接合，因此他们在开始之前都被阻滞了。这意味着cdc2在细胞周期中有两个作用，两个时期都有cdc2参与控制。第一个作用于G1控制开始，第二个作用于G2的限速控制，确定有丝分裂的开始。我现在非常兴奋，而且我也学到了一个重要的教训。我确信我知道“正确”的答案，所以当“错误”的答案出现时，我认为实验结果是错误的。我学到的教训是始终认真对待结果，再也不能将令人不舒服的结果当做没看见一样的扫入地毯下。
G1期和G2期的结果表明cdc2是对于控制细胞周期至关重要。但是真正更深一步的了解这回其中的原理有两个困难。首先，我所得到的理解本质上是抽象的，只有概念和基因名称，但缺乏任何分子机制。第二个是它应用于裂殖酵母，虽然我心中很珍惜，但是世界其他地方对于裂殖酵母的兴趣相当有限。这两个问题都可以通过分子遗传学来解决。如果可以克隆cdc2基因，可以用分子生物学研究其功能，就可以更容易地与其他生物进行比较。这个时候，我在布莱顿的苏塞克斯大学担任一个小实验室的独立研究员，我决定建立裂殖酵母载体、基因库和基因操作技术的方法，我的同事David Beach花了一年左右才完成所有这些工作。然后，实验室通过使用裂殖酵母文库拯救温度敏感的cdc2突变体克隆了cdc2基因，大概就是遗传互补方法。这是一个伟大的时刻。我们在Eppendorf管中的2kb DNA片段上存在cdc2基因。所有以前的抽象概念都可以变得更加具体。此时，甚至像2 kb这样的小片段的测序需要花费数月时间，所以在此期间我们决定使用相同的克隆方法拯救cdc2突变体，但这次使用芽殖酵母库来查看是否芽殖酵母中存在相同的基因。我对使用遗传互补从不同生物体中找到功能相当的基因的可能性感到兴奋，所以我不断地在实验室进进出出，看看是否有任何酵母克隆长大。到了这个时候，我骑的是一辆50cc的轻便摩托车，这比我原来的坐骑自行车已经有所进步，但这进步也不是很多。令我惊讶的是，一天早上我发现一些菌落长大了;似乎在芽殖酵母中可能存在相当于cdc2的基因。也许细胞周期控制是保守的，至少在简单的真核生物中是如此。
问题是芽殖酵母哪个基因呢？Steve Reed那时候只从芽殖酵母中克隆了四个cdc基因，他慷慨地把它们都送给了我们，以便我们测试其中一个是否是我们克隆的基因。但是，鉴于酵母中有超过5,000个基因，我们不可能再次那么幸运，但通过Southern杂交我们发现裂殖酵母cdc2基因与芽殖酵母CDC28基因相同。这是Steve克隆的四个基因之一，也是Lee在G1细胞周期控制中挖掘出来的基因之一。cdc2序列在数据库中只有一个匹配—src致癌基因，被认为编码蛋白激酶。这条弱弱的线索让我的实验室和Steve Reed的实验室合作，通过分子遗传学和生物化学证明cdc2 / CDC28是一种蛋白激酶，细胞周期控制是基于蛋白质的磷酸化。
我很高兴继续使用裂殖酵母来研究这种细胞周期控制的细节。但我也想知道细胞周期的控制是否在所有真核生物中都是保守的。由于芽殖酵母和裂殖酵母没有那么密切相关，所以如果这些酵母之间存在保守性，那么也许人类中也存在保守的cdc2。我后来被Walter Bodmer招募到伦敦帝国癌症研究中心的Inn Fields实验室，我的同事们一直问我细胞周期控制在人体细胞中是否保守。但我很担心浪费我的实验室同事的时间在这样一个明显的长期项目上。然后一位大胆的博士后Melanie Lee来到我的实验室并要求要尝试一个艰难的项目。我们认为在人体细胞中寻找cdc2将是非常困难的，特别是考虑到酵母和人类之间的进化分歧可能要追溯到大约15亿年前。
Melanie开始寻找人体细胞中的DNA片段，这些片段在结构上类似于裂殖酵母cdc2基因：首先，使用酵母cdc2的抗体与人的基因表达文库组合；其次，使用降低严格性的Southern印迹来杂交。我需要提醒你们，那时候还没有全基因组序列，没有PCR，只有有限的基因库。这对Melanie来说是一个非常艰难的项目。鉴于人类和酵母之间存在巨大差异以及存在数百种不同蛋白激酶的事实，它本身似乎也不太可能行得通。考虑到进化的分歧，如何才能知道找到的基因是不是正确的？证明你候选基因与cdc2具有相同功能的唯一方法是它可以拯救裂殖酵母cdc2突变体。因此，正如CDC28被克隆出来一样，前进的方向必须是功能上能够挽救，并对该基因进行克隆。Hirota Okayama和Paul Berg慷慨地给出了一个非常好用的人类cDNA文库，并且偶然发现该文库在裂殖酵母中表达。Melanie来上班后来发现许多培养皿，来自cdc2温度敏感突变体的克隆在高温下生长。但它是一种污染物，一种回复体，一种已经吸收了酵母基因的质粒，还是一种充当抑制因子的人类基因？检查所有这些可能是我工作生涯中最紧张的时期，因为如果这个正在生长的克隆确实包含人类cdc2基因，那么细胞周期控制很可能对所有真核生物都是保守的，这个结论将非常重要。随着每个星期过去，我开始害怕去实验室，以防当天的实验表明我们失败了。Melanie似乎总是很冷静，但我不是。我开始对自己说，“让我们想象一下，如果仅仅是几天，我就能体会到一个成功的结果，但是很有可能又会在下周破灭。”当我们消除了越来越多琐碎的可能解释，这个项目变得越糟糕。最终我们处于边缘：我们知道它是一个人类DNA片段，正在拯救cdc2温度敏感突变体，但它只是一个高拷贝数抑制因子，还是它是cdc2的人类同源物？DNA序列和翻译的蛋白质序列是最终测试。
这最终测试结果在一天中午左右将要出现在电脑屏幕上。我们在实验室相当阴沉和幽闭的走廊等待结果，我一直在紧张地来回踱步。计算机完成了它的工作，当一个个字母走过时，我们都挤在屏幕上，标出预测的蛋白质序列。DNA序列高度不同，但翻译的蛋白质序列则相似度很高。蛋白质在氨基酸序列中到处都显示出同一性和相似性。总的来说，蛋白质的相似性超过60％，蛋白质的长度只差一个氨基酸。酵母和人类基因在结构上相似且功能相同。它们是具有相同功能的相同基因，尽管有多达15亿年的分歧。我们欣喜若狂，完全地欣喜若狂。一个故事在13年前开始并且涉及实验室中的许多同事，最终证明了我梦寐以求的结果。已经在酵母细胞中研究出的细胞周期控制原理，在人类细胞中大致相同。鉴于此，我们认为细胞周期的控制原理可能在所有真核细胞中都是相同的。
我印象最深刻的是什么？我们所生活的世界的多样性其实建立在共同的原则之上，细胞周期控制的分子机制是如此的相似与保守。并且最重要的是，那是一种汹涌而来的解脱，一种巨大的满足感与完整感。
原文链接：
https://www.cell.com/fulltext/S0092-8674(16)30672-9
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