独脚金内酯（strigolactone，SL）是新发现的一种重要植物激素，在植物分枝和生长发育中具有重要的作用。近年来，关于独脚金内酯的生物合成，生理作用机制以及信号转导的研究取得了重要进展。2013年，李家洋院士课题组和万建民院士课题组背靠背发表了两篇Nature，报道了独脚金内酯信号转导分子机制。2016年清华大学谢道昕教授团队与合作者在 Nature （Yao et al., 2016）上发表论文，首次证明了D14 蛋白是同时具有酶和受体双重功能的新型激素受体，并对D14 感知 SL 的过程，提出了＂闭合状态＂假说模型。Nature 同期的News & Views也对该工作做了评述和推荐。独脚金内酯受体及其相关识别机制的发现，为深入了解独脚金内酯的作用机制奠定了重要基础。2018年11月，美国华盛顿大学教授 Ning Zheng 团队在 Nature 上发表了一篇论文 (Shabek et al., 2018)，再次证明D14 蛋白是SL的受体，但是对于 SL 的信号传导过程，提出了＂开放状态＂假说模型。两项研究都确定了 D14 是 SL 的受体，然而两项工作为何提出了不同的感知模型？
研究背景
独脚金内酯（strigolactone，SL）作为一种最新被发现的植物激素【1,2】，参与调控植物分枝这一重要农艺性状及其它生长发育过程。目前已鉴定的所有天然SL分子都是萜类小分子化合物，在化学结构上都包含一个三环内酯（ABC环）和一个由烯醇醚键连接在一起的单环内酯（D环）（图1）。天然 SL 分子结构的多样性是由 ABC-ring 的变化引起的，而其 D-ring 则严格保持不变【3】。
图1. 独脚金内酯（strigol）的分子结构
通过分析拟南芥、水稻、豌豆等模式植物的多分枝突变体，SL 调控植物分枝的分子机制研究取得了显著进展。其中一个重要的发现是，D14 蛋白作为 α/β 水解酶具有催化中心（开放状态的催化中心可以结合 SL 分子）、并把 SL 分子水解为 ABC 环及 D 环这两个都没有生物活性的水解终产物，然而，该水解过程却是 D14 调控植物分枝的必要条件：一旦 D14 失去水解功能（如催化中心发生突变），突变体植物就不能正常调控分枝、表现为异常的多分枝【4】。同样重要的发现是，水稻中的 SL 通路抑制蛋白 D53 和 F-box 蛋白 D3（拟南芥中同源蛋白为 MAX2）参与 SL 介导的植物分枝调控。SL 促进 D14 分别与 D3 及 D53 相互作用，D3 进而参与泛素化 D53 并使之通过 26S 蛋白酶体降解，从而解除 D53 对 SL 信号通路的抑制作用，其下游基因得到表达，调控植物正常分枝【5,6】。
受体研究突破
SL 受体研究一直是引人关注的重要科学问题，研究人员推测 D14、D3、D53 均有可能作为受体或共受体参与 SL 信号的感知。直到 2016年 Nature 期刊报道【7】，清华大学教授谢道昕、饶子和、娄智勇等研究人员，通过对 D14 和突变蛋白 D14-G158E 的生物化学和分子遗传学鉴定、对 D3-ASK1 蛋白质的晶体结构分析、对 SL 诱导的 D14-D3-ASK1D14 蛋白复合体的晶体结构和生物质谱分析，发现 D14 蛋白是同时具有酶和受体双重功能的新型激素受体。D14 水解各种不同结构式的 SL 分子，都生成相同的来源于 SL D环的、共价结合催化中心的活性分子CLIM，其构象发生变化，关闭了催化中心的盖子（lid），使 D14 从＂开放状态＂变构为＂闭合状态＂、形成新的界面去结合 D3。该研究还发现 D3 因结合＂闭合状态＂的 D14、可在体外抑制 D14 对 SL 的水解功能，并揭示了 D14-D3 之间广阔的相互作用面及其在 SL 信号传递中的重要功能。该研究表明，D14 在水解 SL 水解过程中发生重大构象变化（D14的盖子关闭）、从＂开放状态＂变构为＂闭合状态＂；该＂闭合状态＂的 D14 结合 D3、形成 D14-D3 复合体，进而招募 D53 并介导其泛素化降解、触发 SL 信号传导链（图2）【7】。与该模型相印证的工作来自于法国 Jean-pierre Bourgin 研究所教授 François-didier Boyer、Catherine Rameau和美国 Salk 研究所教授Joanne Chory等研究人员的报道，他们也发现了受体 D14 与活性分子 CLIM 的共价结合，并强调该共价结合的受体-激素复合体的形成是 SL 发挥生理功能所必须的【8】。
图2. SL 受体 D14 调控植物分枝的两种理论模型
2018年， Nature 期刊再次报道【9】，美国华盛顿大学教授 Ning Zheng 等研究人员解析了 D3-ASK1 复合体三种构象的晶体结构（ASK1蛋白起稳定D3的作用），发现 D3 的其中一种构象与2016年报道的 D3-ASK1 以及 D3-ASK1-D14-CLIM 中的 D3 构象相近，而在余下的两种构象中，D3 C末端的LRR20（CTH）脱离了整个 LRR domain。使用高浓度体外重组表达的D3 CTH区域的一段小肽（D3-CTH，14个氨基酸残基），在体外可以抑制 D14 对 SL的水解功能。Ning Zheng等研究人员进一步将 D3-CTH 融合到 D14 的N端、表达为一个嵌合蛋白（D3-CTH-D14），并解析了 SL 类似物 GR24 处理下的该嵌合蛋白的晶体结构。在这个嵌合蛋白的结构模型中，D3-CTH 结合＂开放状态＂的 D14（D14的盖子没有关闭，仅发生了细微的旋转），电子密度显示该＂开放状态＂D14 的催化中心含有一个从体积大小上看类似于 D环的分子。研究人员认为，D14 结合未水解的完整的SL分子时，构象发生轻微变化，仍处于＂开放状态＂；该＂开放状态＂的 D14 结合 D3 蛋白、形成 D14-D3 复合体，进而招募 D53 并介导其泛素化降解、触发 SL 信号传导链（图2）【9】。
总之，2016年谢道昕等的研究工作和2018年Ning Zheng等的研究结果均表明，D14 蛋白是同时具有酶和受体双重功能的新型激素受体。但是，对于 D14 作为受体感知 SL 的具体过程，两个研究团队基于各自的研究结果、分别提出＂闭合状态＂或＂开放状态＂的 D14 触发 SL 信号传导链的两种假说模型（图2）。两种模型的主要区别在于，前者利用 D14 和 D3 两个具有正常功能的全长蛋白质，解析了 SL 诱导形成的 D14-D3 蛋白复体的晶体结构，发现＂闭合状态＂的 D14 招募 D3 蛋白触发 SL 信号传导链；后者则将 D3 的14个氨基酸残基与 D14 进行融合得到了一个可能无法发挥正常功能的嵌合蛋白，解析了 SL 处理下的嵌合蛋白的晶体结构，推测＂开放状态＂的 D14 招募 D3 蛋白触发 SL 信号传导链。
模型的验证与挑战
1采用 SL 受体激动剂来检验两种模型
目前报道的绝大部分 SL 受体激动剂具有由烯醇醚键连接的D环，在理论上均可被α/β水解酶催化水解，仅有极少数为非水解激动剂，其生理活性也远低于可水解的 SL 类似物 GR24 等分子，进一步暗示 SL 的水解过程在 SL 信号感知过程中具有重要作用【10】。另外，也有观点认为这些人工合成的自然界不存在的非水解激动剂分子也可能结合在了受体其它未知部位去发挥作用【10】。然而，目前发现的非水解激动剂，主要作用于 HTL/KAI2 蛋白调控种子萌发（HTL/KAI2是D14的旁系同源蛋白），暂无作用于 D14 且调控植物分枝的报道，其作用机理更未阐明。因此，目前无法利用非水解激动剂检验这两种模型。尽管如此，非水解激动剂的作用机理在理论上均可被上述两种 D14 的工作模型所解释（图3）。当然，适合于天然 SL 分子的理论模型没有必要适合所有人工合成的非天然激动剂，这些非天然激动剂也可能以完全不同的机制发挥作用【10】。
图3. D14 激动剂调控植物分枝的理论模型
2采用 d14 遗传突变体来检验两种模型
通过遗传突变策略获得一类 d14 突变体植株，它们含有的 D14 突变蛋白能结合未水解的完整 SL 分子，却无法由＂开放状态＂变构为＂闭合状态＂。谢道昕等的模型表明＂闭合状态＂的 D14 结合 D3 触发 SL 信号链，而这类 d14 突变体植株缺乏＂闭合状态＂的 D14 受体，不能正常结合 D3，因此不能正常调控分枝，将表现为异常的多分枝。Ning Zheng 等的模型则表明＂开放状态＂的 D14 结合 D3 触发 SL 信号链，这类d14 突变体植株中存在＂开放状态＂的 D14 受体、可正常结合 D3，因此将表现为正常分枝。所以，观察这类 d14 突变体植株的分枝表型就可以检验两个模型的可靠性：植株分枝异常则表明前者模型可靠，植株分枝正常则表明后者模型可靠。
迄今为止，己报道的实际观察结果表明，这类d14突变体植株分枝异常，验证了谢道昕等提出的模型的可靠性（图4、图5）：
① d14-5突变体中的 D14 蛋白发生了 G158E 单个氨基酸突变（D14-G158E）。由于 G158E 位点位于 D14 的盖子上、影响了 D14 盖子的关闭，阻碍 D14 变构为＂闭合状态＂，却可以高效结合并水解 SL。该位点处于 D3-CTH 的结合位点之外，也不影响 D14-G158E 与 D53（拟南芥中的同源蛋白SMXL）的相互作用。该d14-5突变体不能正常调控其分枝、出现异常的多分枝【7】，符合谢道昕等提出的模型（图4）。
图4. 具酶活 d14 突变体（多分枝）对两种理论模型的检验
② 当 D14 发生 H247A 氨基酸突变时，不会显著影响与SL分子的结合【11】，但由于 H247A 位于 D14 的催化中心，D14-H247A 蛋白无法催化 SL 的水解，不会出现由 SL 水解所诱导的＂闭合状态＂。含有该 D14-H247A 蛋白的d14突变体植株分枝异常【4】，符合谢道昕等提出的模型（图5）。
图5. 无酶活 D14突变体（多分枝）对两种理论模型的检验
另外，Ning Zheng等基于一个嵌合蛋白的晶体结构（D3 的14个氨基酸残基 D3-CTH 与 D14 进行N端融合形成一个可能无法正常发挥功能的嵌合蛋白），提出了 D3 结合＂开放状态＂的活化 D14 的模型；通过发现高浓度的 D3-CTH 小肽抑制 D14 水解 SL 功能的现象，推测了全长 D3 功能蛋白结合＂开放状态＂D14 从而抑制 D14 酶活的机理；通过发现嵌合蛋白的晶体中岀现 GR24 的水解产物 D环分子，推断该 D环小分子代表未水解的完整的 GR24 分子。Ning Zheng等的核心结论主要基于上述推测或推断。然而，融合在 D14 蛋白上的 D3-CTH（14个氨基酸残基）的结合方式，能否反映 D3 全长蛋白结合＂开放状态＂ D14 的方式？此时＂开放状态＂ D14 中的 SL 分子是否已发生水解？D3 全长蛋白能否通过结合＂开放状态＂D14 去抑制 D14 水解 SL 的活性？这些疑问均有待验证。利用 D3 全长蛋白与 D14 突变蛋白（D14-G158E）进行 SL 水解活性抑制实验和蛋白复合体结构解析，可以进一步检验Ning Zheng等提出的模型。
最后，值得一提的是，上述两个模型并不相互排斥，可以相互融合，两者都揭示 D14 是 SL 的受体，都认为＂闭合状态＂的 D14 可以结合 D3、招募 D53 并介导其泛素化降解【7,9】。
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