2020年1月7日，上海交通大学农业与生物学院王文琴和中国科学院分子植物科学卓越创新中心巫永睿团队在Nature Communications杂志上在线发表题为Long-read sequencing reveals genomic structural variations that underlie creation of Quality Protein Maize的研究文章。该研究通过PacBio三代基因组测序，BSA-seq遗传定位和RNA-seq转录组分析相结合的手段，深入解析了优质蛋白玉米（Quality Protein Maize, QPM）选育的基因组结构变异基础，全面挖掘了潜在的硬质胚乳修饰因子。
玉米和大豆是世界上最重要的两种粮食和饲料作物。大豆蛋白含量高，但是产量较低；玉米产量高，但是蛋白含量不足。1896年，美国伊利诺伊大学Cyril G. Hopkins教授启动了延续长达百年、堪称玉米蛋白含量选育的世纪工程项目，迄今实现了玉米中蛋白含量从原本只有10%左右猛增到30%。然而在这项实验开展的早期阶段，美国植物蛋白生化学家Thomas B. Osborne和Lafayette B. Mendel等人1914年就已经发现玉米的主要存储蛋白是醇溶蛋白，它们基本不含人体和单胃动物（比如猪）必需的氨基酸赖氨酸和色氨酸，因而营养品质不佳。而Hopkins教授选育的高蛋白玉米提高最多的恰好就是醇溶蛋白，因此它的营养品质更显低劣。进入二十世纪20年代，美国科学院院士Donald F. Jones的助手Ralph Singleton博士发现一个白色硬粒玉米的新英格兰变种中有一个突变体是粉质胚乳表型。当时他们并不知道这个粉质突变体会有什么育种价值，但作为遗传学家，Jones仍一直坚持繁育保种，以备不期之用，而这就是后来诸多遗传学家，育种学家和生化、分子生物学家前赴后继研究了多半个世纪的opaque2 （o2）突变体。
玉米原产美洲，在哥伦布发现美洲大陆后的1493年左右被带到欧洲，然后渐次传播到世界其它地方。当时，玉米一般比其它作物产量高，一旦被带到某个地方，很快便在当地被广泛种植。然而，只要玉米成为新种植区域人们的主食，该区域便会经常爆发糙皮病（Pellagra）和蛋白营养不良症（kwashiorkor）。这个病因困扰了人们数百年，直到上世纪三十年代，美国国立卫生研究院医生Joseph Goldberger才最终发现诱发这种病是因为患者食物中缺乏维生素B3，而合成维生素B3的前体恰恰是玉米醇溶蛋白中缺乏的第二大人体必需氨基酸——色氨酸。在明晰玉米蛋白营养品质不佳的原因后，育种家便开始尝试从自然群体中筛选高赖氨酸和色氨酸材料，但几十年过去了仍然毫无进展。
美国普渡大学是作物品质育种研究的摇篮。Edwin T. Mertz是普渡大学研究生物化学的美国科学院院士，他认为既然是醇溶蛋白导致玉米缺乏赖氨酸，那么抑制醇溶蛋白表达然后其它富含赖氨酸的蛋白表达上升或许就可以提高籽粒赖氨酸的总体含量。Mertz在一次学术会议上阐述自己想法的时候恰好本校的另一位美国科学院院士玉米遗传学家Oliver E. Nelson也在场，Nelson当场赞同并认为极具可操作性。根据以往研究Nelson做出如下推论：伊利诺伊高蛋白玉米主要是提高了醇溶蛋白含量，赖氨酸含量反而更低，籽粒比普通玉米变得更硬质；相反，如果某些突变体是粉质表型，那么醇溶蛋白可能会降低而赖氨酸会升高。Nelson正是前文提到的那位一直繁育o2突变体的Donald F. Jones院士的博士生，而且Nelson院士自己也收集了很多玉米粉质突变体并展开研究。Mertz和Nelson于是开始合作，他们发现o2突变体的赖氨酸和色氨酸含量果然显著提高，含量大约是普通玉米的一倍；他们接着发现fl2和o7也是高赖氨酸材料，但含量不及o2。他们通过小鼠饲养实验更发现o2玉米的确比普通玉米明显具有更高的营养价值。这一系列重要成果发表在了1964和1965年三篇Science上。
然而，o2高赖氨酸材料的商业化育种远非一帆风顺，反倒经历过诸多坎坷。o2是粉质胚乳表型，籽粒易碎而发霉感病，直接用于生产必然导致灾难性的损失，因此育种家们对o2材料的利用由起初的热情高涨、争先恐后，很快就变得心灰意冷，望而却步。玉米是种内不同品种间基因组变异非常大的物种，这些变异程度远远超过了人和黑猩猩的区别，这么巨大的变异同时蕴含着玉米育种的无限可能。墨西哥国际玉米小麦改良中心（International Maize and Wheat Improvement Center, CIMMYT）生化遗传学家、Mertz院士的博士生Evangelina Villegas和育种学家Surinder Vasal合作，通过筛选胚乳修饰因子QTL（o2 modifiers），把o2的粉质胚乳表型恢复成了硬质胚乳，同时还保持高赖氨酸性状，这种硬质类型的o2玉米就称作优质蛋白玉米（图1）。优质蛋白玉米育成以来，已经被南美，亚洲和非洲的23个国家引进，每年种植面积超过6千万亩。因选育的优质蛋白玉米大大改善了以玉米为主粮的发展中国家人群特别是儿童的营养不良症，这两位科学家因此获得了2000年的世界粮食奖。
图1. 优质蛋白玉米的修饰因子分离。从左到右：无，部分，大部分和完全修饰。
优质蛋白玉米育种对我国同样具有特别重要的意义。2019年全国玉米总产量2.6亿吨，如果全部用于养猪，料肉比只有5.4: 1，产肉4829万吨，人均为34.6 公斤 (实际30 公斤)，将是世界平均水平42 公斤的80%左右；如果用优质蛋白玉米饲养，料肉比降低至3.5: 1，人均猪肉消费可增加到53.4 公斤。优质蛋白玉米作为饲料的另一优势是生猪可以充分吸收并同化蛋白质氨基酸，减少粪便中氮的排放，从而降低环境保护压力。我国优质蛋白玉米研究工作起源于上世纪七十年代，在育种上取得了很多重要进展。然而，由于优质蛋白玉米的分子遗传机制研究比较滞后，新品种培育和开发面临严峻挑战。优质蛋白玉米来源于CIMMYT的热带种质资源，而我国玉米主产区处于温带，优质蛋白玉米引进后，我国育种者面临的主要问题之一是如何将控制高赖氨酸性状的o2突变基因和控制胚乳修饰作用的多个数量性状因子导入我国属于温带种质资源的骨干自交系中。在这个过程中，育种者不可避免地要在每一代监控隐性o2和修饰因子的存在，工作非常烦琐。现在通过SSR标记的辅助，在每一代中都可以较为容易地检测o2等位突变基因，但众多胚乳修饰因子QTL依然缺乏合适的标记。因此我国育成的很多优质蛋白玉米材料可能已然丢失了一些修饰因子，胚乳修饰程度不如亲本材料高，呈现半硬质表型，因此难以大面积推广。虽然优质蛋白玉米胚乳修饰机理研究已经取得了许多重要进展，但由于缺乏优质蛋白玉米参考基因组序列，目前只有个别胚乳修饰因子被克隆，远远不能满足当前分子育种的紧迫需求。
图2. K0326Y基因组全局图
上海交通大学王文琴团队长期致力于通过计算生物学及与分子生物学相结合的手段，研究玉米复杂农艺性状。为挖掘优质蛋白玉米所有胚乳修饰因子，该团队与中科院及美国合作者对来自南非的优质蛋白玉米自交系K0326Y基因组进行了三代测序，最终组装出的基因组大小为2148 Mb，contig N50 达到了7.77 Mb （图2）。对K0326Y与冷泉港Doreen Ware 团队拼装的B73和中国农业大学赖锦盛团队的Mo17进行比较基因组学分析，他们发现K0326Y与其它两个玉米基因组之间有丰富的序列多样性及结构变异，这构成了玉米品种间多样性的主要原因。同时，当对K0326Y和W64Ao2的F2群体进行了BSA-seq分析，对两组优质蛋白玉米和o2突变体（K0326Y vs W64Ao2和CM105Mo2 vs CM105o2）进行了RNA-seq分析，他们鉴定到了1,791个共同差异表达基因。结合以上数据，他们发现了一些与多个胚乳修饰因子遗传位点紧密相连的候选基因，这些基因具有结构变异和表达水平的改变等遗传特征。据此并结合近期其他研究成果，他们提出了解释优质蛋白玉米硬质胚乳形成的分子机制模型（图3）。他们构建的高质量优质蛋白玉米基因组以及鉴定出的具有结构变异和表达差异的候选基因将会促进优质蛋白玉米胚乳修饰因子分子标记开发及分子育种。
图3. QPM 修饰因子的模式图
上海交通大学农业与生物学院博士后李长生和中科院分子植物科学卓越创新中心博士后向小利为本论文共同第一作者。中国科学院分子植物科学卓越创新中心博士生黄永财和博士后周勇，上海交通大学博士后安冬等人参与了该工作。华大基因赵辰曦、山东农业大学刘红军教授、青岛农业大学李玉斌教授、美国新泽西州蒙克莱尔州立大学杜春光教授、长期致力于优质蛋白玉米研究的美国亚利桑那大学Brian A. Larkins院士，美国罗格斯大学Joachim Messing院士及其博士后董家强也参与了合作。上海交通大学农业与生物学院王文琴和中国科学院分子植物科学卓越创新中心巫永睿为本文共同通讯作者。这项研究得到了科技部，国家基金委和中科院的大力支持。
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