科研 | SBB：一站式氨氧化细菌在氮添加土壤中发挥着积极作用(国人作品)

编译：helinfeng，编辑：小菌菌、江舜尧。

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导读

硝化作用，是NH₃经过一系列微生物氧化，由NO₂^-转变为NO₃^-的过程，是全球N循环的重要过程。经典的硝化过程包含由氨氧化古菌（AOA）和氨氧化细菌（AOB）参与完成的NH₃——NO₂^-的过程以及由亚硝酸氧化细菌（NOB）参与完成的由NO₂^-——NO₃^-过程。自从AOA被发现能够氧化NH₃，人们对于AOA和AOB在氧化NH₃的能力上的生态位分化以及二者在氮循环的相对重要性一直争论不止。但是已有大量生理学和基因组学的证据表明AOA更倾向于寡养环境，生活在酸性土壤和N匮乏环境中，而AOB通常更适合于富氮环境。2015年，人们发现了一种完全氨氧化细菌（Comammox Nitrospira），能够直接将NH₃氧化为NO₃^-，颠覆了人们长期以来对硝化作用的认识，有研究表明，这种“一站式”氨氧化菌具有较高的氨亲和力，有利于在贫养环境中获得竞争优势。大量研究表明，Comammox Nitrospira广泛分布在低氨的水生和陆生生态系统中，这些发现又将引发新一轮的争论——Comammox Nitrospira与典型的氨氧化菌的生态位分化问题以及他们在全球N循环过程中的相对重要性。本文选取农业土壤，利用微宇宙培养法和DNA-稳定同位素探针法来探讨Comammox Nitrospira对硝化作用的潜在贡献以及不同的硝化微生物的生态位分化问题。

论文ID

原名：Comammox Nitrospira play an active rolein nitrification of agricultural soils amended with nitrogen fertilizers

译名：一站式氨氧化细菌在氮添加土壤中发挥着积极作用

期刊：Soil Biology and Biochemistry

IF：5.3

发表时间：2019.09

通讯作者：贺纪正

作者单位：澳大利亚维多利亚州墨尔本大学兽医与农业科学学院

实验设计

本研究的实验用土取自澳大利亚的两个长期观测农牧场——Dookie的奶牛场和Clyde的蔬菜种植场。Dookie种植多年生黑麦草（Lolium perenne）和白三叶草（Trifoliumrepens），土壤质地为沙壤土（silty loam），Clyde的蔬菜种植场土壤质地为壤质沙土（loamy sand），种植芹菜，过去的几年施用鸡粪和无机肥。使用直径5cm的土钻在整个实验位点随机钻取10cm深的上层土壤共40钻，混合均匀后装入塑料桶加冰运回实验室。土壤样品过2mm筛，去除植物残留根、石块，充分混合均匀储存在4℃冰箱3-5天用于土壤微宇宙实验。

1.土壤微宇宙培养实验

使用250ml的塑料瓶，装入20g土壤样品，使用硝化抑制剂C₂H₂（非专性抑制剂，抑制AOA和AOB氨单加氧酶活性）和C₈H₁₄（专性抑制剂，抑制AOB单加氧酶活性），两种抑制剂对ComammoxNitrospira影响未知，以(NH₄)₂SO₄作为氮肥，具体实验设计为：2种土壤类型×4种处理×3重复，4种处理分别为：①空白②(NH₄)₂SO₄③(NH₄)₂SO₄+C₂H₂ ④(NH₄)₂SO₄ +C₈H₁₂，恒温25℃黑暗培养28天，土壤含水率保持在55%，在0、3、7、14、21、28天破坏性采集土壤样品，保存在-80℃用于分子分析和矿质氮素含量分析。对于土壤理化性质，测定pH、总C、总N、以及NO₃-N和NH₄-N、有效P、有效S以及K元素含量。

2.DNA-SIP微宇宙培养实验

使用160ml的血清瓶，装入10g的鲜土样品，进行DNA-SIP标记培养实验，以检测comammoxNitrospira和典型氨氧化菌将¹³C整合到基因组的的代谢活性。

具体实验设置：①(NH₄)₂SO₄（100mg NH₄-N soil kg^-1soil）+5%（vol/vol）¹²CO₂ ②(NH₄)₂SO₄ +5%¹³CO₂（0.1% vol/vol）③(NH₄)₂SO₄+5%¹³CO₂+C₂H₂（0.1%v/v）④(NH₄)₂SO₄+5%¹³CO₂+C₈H₁₄（0.03% v/v），恒温25℃黑暗培养28天，土壤含水率保持在55%，保持瓶中上方CO₂、C₂H₂、C₈H₁₄浓度恒定，在0和28天破坏性采集土壤样品，保存在-80℃用于后续amoA基因丰度分析以及系统进化分析。

图1.实验流程图

结果

1 微宇宙培养过程中土壤性质变化

测定短期培养过程中4种处理下的耕作土壤和草地土壤NH₄-N和NO₃-N的浓度，对照组中的NH₄-N浓度在两种土壤中基本保持不变（Fig.2A和B），而NO₃-N浓度随时间持续升高，表明两种土壤中有持续的硝化活性（Fig.2C和D）。(NH₄)₂SO₄处理中，NH₄-N浓度快速降低到与对照组相同的水平，而NO₃-N浓度急剧增大，表明高的氨氧化速率。(NH₄)₂SO₄处理下的两种土壤净硝化速率均显著高于对照组（P＜0.05）。C₂H₂的添加使得草地土壤NH₄-N浓度显著升高（Fig.2A），可能是由于有机氮素的矿化，但C₂H₂添加对耕作土壤无显著影响（Fig.2B）。在添加硝化抑制剂的两种处理下，NO₃-N的浓度显著低于(NH₄)₂SO₄处理下的浓度（P＜0.05）。C₂H₂的添加几乎完全抑制了两种土壤的硝化作用，C₈H₁₄则是部分抑制（Fig.2C和D）。

图2 草地土壤与耕作土壤微培养过程中铵根和硝酸根浓度的变化

2 微宇宙培养过程中amoA基因丰度

使用qPCR对Comammox Nitrospira和AOA、AOB群落进行定量。对照组中，comammox Nitrospira的amoA在草地土壤中的基因丰度范围为4.32×10⁷-9.26×10⁷copies/g，在耕作土壤中为1.77×10⁷-3.28×10⁷copies/g（Fig.3），在第三天观测到最大值。与对照组相比，添加(NH₄)₂SO₄显著增加了草地土壤中comammoxNitrospira clade A在第7天和14天的丰度，但在耕作土壤中未观测到显著变化（Fig.3）。Comammox Nitrospiraclade A丰度在两种硝化抑制剂的处理下表现出相反的趋势。与(NH₄)₂SO₄处理相比，添加C₂H₂显著降低了comammox Nitrospira clade A的丰度，在草地土壤中从第0天的7.98×10⁷ copies/g到第28天的2.62×10⁷ copies/g，在耕作土壤中从第0天的1.63×10⁷ copies/g到第28天的8.67×10⁶ copies/g（Fig.3）。相比之下，C₈H₁₄的添加在第3天后对两种土壤中ComammoxNitrospira clade A并无明显的抑制作用。

AOA的基因丰度在两种土壤中对(NH₄)₂SO₄和两种硝化抑制剂的的响应呈现相似规律。添加(NH₄)₂SO₄后，AOA的基因丰度在两种土壤中显著增大（P＜0.05）（Fig.3）。相较于(NH₄)₂SO₄处理，在两种土壤中，C₂H₂显著抑制了AOA的生长（P＜0.05），而C₈H₁₄对AOA基因丰度无明显抑制作用。在添加C₈H₁₄耕作土壤中，AOA的基因丰度随时间显著增大（P＜0.05）（Fig.3）。对照组中的AOB丰度在两种土壤中均随时间呈下降趋势（Fig.3）。与对照组相比，添加(NH₄)₂SO₄显著增大了两种土壤中AOB的丰度（P＜0.05）。添加硝化抑制剂不同程度地显著抑制两种土壤中AOB的生长（Fig.3）。

图3. amoA在两种土壤中Comammax Nitrosipra clade A和AOA、AOB微宇宙培养实验基因丰度的变化。误差棒表示三个重复观测的标准误。*代表P < 0.05，**代表P< 0.001.

3 DNA-SIP追踪活性氨氧化细菌

研究人员利用一个28天的¹³CO₂DNA-SIP微宇宙培养实验来追踪硝化过程中功能活性氨氧化细菌。DNA片段中amoA的qPCR分析结果表明，Comammox Nitrospira clade A和AOA在两种土壤中均被标记，而AOB仅在耕作土壤中被标记。两种土壤中Comammox Nitrospira clade A的相对丰度在¹²CO₂处理下的达到最大值，浮力密度约为1.70-1.71（g/ml）（Fig.4）。经过28天的培养，Comammox Nitrospira clade A群落的峰值在两种土壤中转向密度为1.72（g/ml）的重组分中，表明大量的comammox Nitrospira clade A在硝化过程中同化¹³CO₂到它们的DNA中。在¹³CO₂+C₂H₂处理下，两种土壤中ComammoxNitrospira clade A在第28天的峰值停留在轻组分中，表明C₂H₂有效地抑制了其活性。然而，C₈H₁₄对comammox Nitrospira clade A的活性抑制在两种土壤中均未观测到（Fig.4）。

在第28天，两种土壤中AOA的丰度在添加¹³CO₂后明显由轻组分（1.69g/ml）向重组分（1.72g/ml）转变（Fig.4）。在¹³CO₂+C₂H₂处理下，两种土壤中AOA丰度的峰值在第28天时与¹²CO₂处理重合，表明C₂H₂显著地抑制了¹³CO₂的同化（Fig.4）。正如预期，在两种土壤中添加C₈H₁₄对AOA的活性无明显影响。耕作土壤中，第28天时AOB大部分被¹³C标记，密度分布在重组分（1.72g/ml）。与¹³CO₂相比，C₂H₂和C₈H₁₄有效的抑制了AOB的生长。相反，¹²CO₂和¹³CO₂处理下的AOB的丰度在草地土壤中无明显变化，表明¹³CO₂并未整合到AOB中（Fig.4）。

图4.在DNA-SIP微宇宙培养中¹²CO₂、¹³CO₂、¹³CO₂+C₂H₂和¹³CO₂+ C₈H₁₄四种处理下获取的comammoxNitrospira clade A、AOA、AOBamoA基因相对丰度的分布状况

4 ¹³C标记硝化细菌的系统发育分析

利用在第28天从重组分区域获得的两种土壤中翻译氨基酸序列构建amoA的系统发育树，草地土壤中代谢不活跃的AOB群落除外。结果表明，耕作土壤中96%的¹³C的Comammox Nitrospiraclade A群落落在Cluster 1，这与很多已发表的comammox amoA基因序列高度相关。有趣的是，草地土壤中82%的¹³C标记Comammox Nitrospira clade A属于独立分支Cluster 2。耕作土壤中¹³C的AOA群落被分到Nitrosopumilus和Nitrosophaera，占获得的AOA amoA基因序列的67%和31%。草地土壤中的AOA群落主要属于Nitrosotalea，占获得的AOA amoA基因的95%。耕作土壤中，¹³C标记的AOB群落属于Nitrosopira Cluster 3，其中78%属于Cluster 3a（Fig.S2）。

图5.从草地和耕作土壤中¹³C-CO₂DNA-SIP重组分中提取的Comammox Nitrospira clade A 翻译氨基酸序列的amoA基因的系统发育分析，草地和耕地的序列分别以蓝色和黄色突出显示，红色数字表示序列一致性大于98%的序列数。节点上的数字表示基于1000个重采样数据集领域连接分析bootstrap值。比例尺表示5%的序列发散，bootstrap值在分支点显示（>50%）

讨论

以往的研究已经认识到氨的有效性是造成AOA和AOB生态位分化的主要因素。农业土壤通常会接受大量的N肥来提高作物产量，而草地土壤接受的大量的N素来自动物粪便。土壤水溶液中NH₃的浓度计算基于电离平衡方程（NH₄⁺↔ NH₃ + H⁺；pKa=9.25，25℃），草地土壤NH₃浓度为159-893nM，耕作土壤为408 -781 nM，这显著高于纯培养的ComammoxNitrospira的氨亲和力63nM。因此，假设生活在寡养环境中的comammoxNitrospira比农业生态系统中的典型的氨氧化菌竞争力更低。然而，与假设相反，该研究表明，两种土壤中comammox Nitrospiraclade A的丰度比AOA和AOB要高一个量级，施用氮肥显著增加了草地土壤中comammox Nitrospiraclade A的丰度，并且它能够将¹³C标记CO₂整合到其基因组上。这些结果表明，comammoxNitrospira clade A在N改良土壤的硝化过程中可能起到积极的作用。

两种土壤中大量的¹³C标记的comammox Nitrospira属于clade A的Cluster 1和2。据我们所知，这是首次在农业土壤中表征¹³C标记的comammox Nitrospiraclade A，这项研究为comammox Nitrospira的Cluster 2提供了有价值的见解，Cluster 2是从comammox Nitrospira Cluster 1中分离出来的，而Cluster 2主要来自氨浓度较低的生态系统。Cluster 2可能代表了comammox Nitrospira clade A的的集合，在农业土壤硝化过程中具有潜在作用。最近的一项研究报道comammox Nitrospira clade B在森林和水稻田中自养生长，在缺乏氨的情况下可能对硝化作用有贡献。因此，我们假设comammox Nitrospira clade A和Clade B在土壤环境中形成生态分化可能是由氨的有效性驱动的，这就需要对一系列具有不同氮矿化潜力的土壤进行进一步研究，或是对不同氨施用量的土壤进行研究，以验证潜在的生态位分离。从来自¹³C标记重组分的DNA-SIP的AOA的amoA基因的系统发育分析表明活性的AOA属于Nitrosopumilus,Nitrosotalea and Nitrososphaera簇，这已经在不同环境被广泛报道与自养氨氧化相关。

本研究的另一个重大发现是土壤中comammox Nitrospira clade A被C₂H₂显著抑制，这是首次关于土壤中的comammox Nitrospira的硝化抑制剂的报道。在comammox Nitrospira被发现之前，很多研究曾尝试在实验室或野外确定专门针对AOA 或AOB的专性抑制剂。结果发现，大多数的硝化抑制剂并非选择性的，它们在很大程度上抑制了功能优势群。例如，在以AOB功能为主的农业土壤中，C₂H₂能有效抑制AOB，而DCD在以AOA为主导的酸性土壤中显著抑制AOA的生长及活性。唯一报道的选择性抑制剂是C₈H₁₄，最近被发现能够专性抑制AOB的生长、活性以及氧化亚氮的产生。我们的研究确认C₂H₂能够抑制AOA、AOB，而C₈H₁₄对AOB由明显抑制作用，并为经C₂H₂处理后的comammox Nitrospira clade A丰度显著降低提供了新的证据。DNA-SIP结果进一步表明，C₂H₂能有效抑制CO₂整合到comammox Nitrospira clade A的基因组中，说明土壤自养完全硝化过程可以通过添加抑制剂来调控。这些结果表明，comammox Nitrospira 氨单加氧酶（AMO）具有催化活性，能够被C₂H₂灭活。与(NH₄)₂SO₄处理相比，添加C₂H₂显著降低了comammox Nitrospira的丰度，可能是因为C₂H₂阻碍了comammox细菌重新合成AMO，导致comammox菌被耗尽。不像AOB，C₈H₁₄并没有抑制两种土壤中comammox Nitrospira clade A的丰度和活性。除了C₈H₁₄对AOB的专一性，我们假设comammox Nitrospira的AMO与AOA的AMO更相似，对C₈H₁₄的长链炔烃不太敏感，抑或是comammox Nitrospira更喜欢NO₂^-作为电子供体。我们的研究结果对更好地理解土壤中硝化抑制剂的分子机制具有重用意义，对完善农业微生物氮循环管理，提高农业氮素利用率，减少农业氮素损失具有重要意义。

结论

我们对comammox Nitrospira的生态位分化和代谢多样行仅限于低氨浓度的工程系统和水生以及陆生生态系统。该研究采用¹³CO₂-DNA-SIP技术和分子生物学方法，结果表明，与以往对comammoxNitrospira的寡养生活方式的认识不同，comammox Nitrospira含量丰富，可能在两种施氮土壤中起积极作用。这些发现为陆地生态系统中comammox Nitrospira生态位分化提供了新的见解，并对未来通过控制完全硝化过程来管理N素的的生物地化循环提供指导意义。

土壤氮素循环一直是生态学研究的热点，该研究从AOA、AOB和Comammox Nitrospira三种不同氨氧化菌出发，选取不同类型土壤，利用微宇宙培养法和DNA-SIP法研究不同氨氧化菌在N改良土壤中的生态位分化以及它们对土壤氮循环的相对贡献度。该研究结果在一定程度上刷新了我们的认识，研究发现Comammox Nitrospira可能在N改良土壤中丰度较AOA、AOB较高，颠覆了人们的以往的认知，同时弥补了我们对不同硝化细菌对全球氮循环的相对贡献认识的不足。

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