致敬Phillip Sharp和周芷——RNA splicing的发现史

我们现在都知道真核生物的大多数基因是不连续的，在从DNA到mRNA的过程中，会先形成pre-mRNA，然后再由剪接体 (spliceosome) 加工成成熟的mRNA，再进行蛋白质的翻译过程。近些年来，随着Cryo-EM技术的发展，剪接体的大部分状态的结构已经得到解析，其催化的分子机制也越来越清晰（详见BioArt报道：『珍藏版』特别报道丨大师Kiyoshi Nagai的遗作与未竟的“RNA剪接”研究）。然而，在完善这个过程的同时，我们也不能忘记当初发现真核生物“断裂”基因的这段历史。2019年底，PNAS刊登了对Phillip Sharp教授（1993年因发现断裂基因而获诺贝尔生理学或医学奖）的人物专访，介绍了该实验室当年发现RNA splicing的精彩过程。

下面将全文编译，与大家共享。

“尾巴”的寻找：DNA剪接的发现

大发现时常隐藏在小细节之中——至少在这篇PNAS的文章中是如此——分子生物学家Phillip Sharp及其研究小组对于一小段RNA的关注和探究，使人们对真核细胞中蛋白质的合成方式有了质的改变【1】。

1970年代，Sharp在麻省理工学院（MIT）癌症研究中心做PI。他此前在James Watson实验室做过博士后，然后在冷泉港实验室（CSHL）任职，之后被MIT聘用。此时，他正从事的方向是研究基因的本质和测量染色体大小。这在遗传学领域是相对原创的—Watson和 Francis Crick仅在20年前发现了DNA的结构。

当时的分子生物学家几乎无一例外地从事细菌系统的研究，因为细菌很容易在实验室中生长。尽管在加州理工学院 (Caltech) 生化学家Norman Davidson实验室做博后期间，Sharp主要研究细菌并发表了有关大肠杆菌基因组的研究成果【2,3】，但他还是开始去开拓肿瘤生物学和病毒学方向。当Sharp到达CSHL时，他将注意力转向了已知会感染动物细胞的DNA病毒。他对人类细胞中的基因表达（将DNA转化为蛋白质的机制）特别好奇，并开始研究猿猴DNA病毒SV40的转录机制。在人类和猴子中都发现，SV40可以产生肿瘤。Sharp对病毒的研究源于与病毒学家Joseph Sambrook的合作。同时，也得益于另一个同事Ulf Pettersson，他致力于研究腺病毒 (Adenovirus) 的DNA复制—Adenovirus是一种具有双链DNA基因组的常见病毒，会在啮齿动物中引起肿瘤并导致人类患多种疾病。

“我和Ulf成为了朋友。” Sharp说，“他对Adenovirus DNA的复制感兴趣；我则对Adenovirus的转录活性和基因定位感兴趣。”

图1. MIT癌症研究中心的成员（Robert Weinberg，左下第二排，最左；Susan Berget，下第三排，左三；Claire Moore，后排，左四；Philip Sharp，后排，右 ）。图片由Robert Weinberg提供。

几年前，微生物学家Daniel Nathans和Hamilton Smith因发现了限制性核酸内切酶【4-6】，并与Werner Arber共同获得了1978年诺贝尔生理或医学奖。根据他们的观点，Sharp开发了一种使用凝胶电泳和溴化乙锭 (EB) 染色纯化限制酶的方法。最终，Sharp、Pettersson和其他人一起绘制了Adenovirus 2和5基因组以及其他几种血清型的限制性图谱。这些图谱被广泛用于鉴定包含致癌基因的病毒区域。

“转录方式对于理解病毒是如何产生肿瘤很重要。” Sharp说，“这也为长期的好奇心奠定了基础：异质核RNA（heterogeneous nuclear RNA）的重要性。”

当Sharp被MIT Center for Cancer Research招募时，他和博士后Jane Flint扩展了腺病毒的转录图谱。Sharp的另一位同事，分子生物学家Robert Weinberg在五楼的隔壁实验室里研究SV40。Adenovirus和SV40均可在被感染的细胞中产生多个拷贝的基因组，这也使研究分析更加便利。

“Phil Sharp和我，以及其他人研究DNA肿瘤病毒（如腺病毒和SV40）的原因并不是因为我们对癌症本身感兴趣，而是因为这些病毒可以为我们复制自己的基因组，” Weinberg说（他目前是Whitehead生物医学研究所研究员，也是MIT的生物学教授）实际上，Weinberg补充道，并非中心的所有组都直接关注癌症这一疾病。“MIT Center for Cancer Research是建立在这样一个观念上——好奇心驱动的研究就可能会产生巨大的收益（curiosity-driven research is likely to yield great benefits）。”

它做到了。在上世纪七八十年代期间，MIT的Center for Cancer Research是著名科学家的研究中心，其中包括David Baltimore（特别推荐丨David Baltimore的退休时刻）和Susumu Tonegawa，他们分别因发现逆转录酶和抗体基因的重组而获得诺贝尔奖。

在1975年左右，Weinberg为该中心的五楼实验室组织了组会，以讨论他们的研究。Sharp当时几乎不知道这些会议最终在具有里程碑意义的发现中扮演不可或缺的角色。

1976年，博士后Susan Berget开始使用电子显微镜测定细胞质RNA与腺病毒DNA结构之间的关系。Sharp和Berget都与负责癌症中心电镜设施的技术员Claire Moore密切合作。通过与Sharp的合作，Moore熟悉了一种称为R-loop分析的技术，该技术当时是在基因组上绘制RNA序列的新方法。通过结合盐、甲酰胺和热量创造出一个最佳条件，Moore可以使RNA链与其互补DNA杂交。

现在为Tufts University的发育、分子和生物化学学教授的Moore说，“您会看到一条细绳（String），并且会出现空泡（Bubble），RNA与DNA杂交置换出另一条链。Sharp认为这将是绘制Adenovirus的好方法，因为您可以精确地定位每个基因的位置。”

Adenovirus可高效复制，因此当Berget用它感染人类细胞系时，大多数mRNA分子将来源于病毒。mRNA充当中介模板，将遗传信息从DNA传递到蛋白质。Berget纯化了最丰富的编码了衣壳蛋白的病毒mRNA，然后给Moore进行杂交实验，以使其与Adenovirus基因组的特定限制性核酸内切酶片段形成R-loop。使用电镜观察得到的R-loop，以及测量的R-loop和双链DNA的长度可以用于确定基因的位置。

“我的任务是准备样品，”Moore说。“有很多技巧可以使样品很好地伸展开来。”

制备样品会用到粘稠的甲酰胺溶液和由玻片制成的坡道。在制备过程中，Moore必须将样品滴在恰好合适的位置上，以使其扩散到薄膜上。一旦Berget和Moore将制好在薄膜上的样品收集在一个涂有塑料的微小网格上，他们便开始对其进行电镜处理。随后将该膜插入电镜并测定可解释的R-loop结构，然后将其照相。为了获得准确的测量结果，会对显微照片进行照相打印。在数十张显微照片的制作过程中，似乎发现了有些不对劲的地方。

Moore说，“我以前得到的是一个均匀的R-loop，但是在这些R-loop的末端，有些单链RNA的小链伸出来（图2），我不知道该怎么办。”

图2.（A–C）Hexon mRNA与Adenovirus基因组片段杂交的电镜照片。照片中的箭头标记了RNA/DNA杂交末端的单链RNA尾巴。mRNA的5'至3'方向在C图中表示，细线表示病毒DNA的另一条单链。

此前，其他实验室也发现核内的Adenovirus RNA远比胞质的mRNA长。研究小组想知道这些长的病毒RNA是否与细胞异质核RNA有关。与Adenovirus RNA相似，这些含有基因序列的核内RNA比细胞质中更稳定的mRNA长得多。

Berget、Moore和Sharp得出的结论是，延伸之一是在转录后添加到mRNA末端的Poly A尾巴，没有链可以与他们杂交。他们假设另一条尾巴是伪影，可能是由DNA再杂交和置换RNA引起的，并且进行了无数次实验验证。他们消除了另一条DNA链，因此没有别的可以与RNA末端竞争。但是，当RNA与单链DNA杂交时，尾巴仍然存在。即使尝试不同条件的甲酰胺和盐也无法成功消除延伸的尾巴。尽管如此，Sharp和他的同事们决心在继续之前排除对尾巴的其他解释。

“我们第一个不明白的结果是，当我们在显微镜下绘制腺病毒mRNA在基因组上的图谱时，我们在RNA的5'端发现了这条尾巴。” Sharp说，“它的行为似乎并不像它是紧邻基因组序列的一部分，我们花了3个月的大部分时间去排除这不是人工产物。”

但是三个月后，经过反复实验，多余的尾巴仍然是个谜。

“直到Sue在一次全楼层的组会上展示数据之前，这还是一个难题，我们认为它可能来自Adenovirus的不同区域，”Moore说。

因此，研究小组尝试将RNA与更长的DNA杂交。

Moore说，“那时候，‘小尾巴’发现了它的伴侣链，并将DNA拉过来形成了新的loop。”

尽管Sharp不确定会期待发生什么，但他回忆道：“当我看到那几个loop时，我就知道了它是什么。”

这就是对异质核RNA之谜的答案。Berget、Moore和Sharp发现了RNA剪接。

在基因转录的这个阶段，或将DNA信息转录为mRNA的过程，类似于一个句子，因为句子中带有很多多余的字母，因此需要对其进行解码。一旦删除了使句子看起来像胡言乱语的那些不必要的字母，就会出现清晰的要表达的信息。在mRNA中，该信息就是指导蛋白质合成的方向。

人类基因组中估计有成千上万的基因，它们提供了产生更多蛋白质的指令，而这些蛋白质绝大部分却是必须通过RNA剪接这一步的。当一个基因被转录成RNA中时，它包含一个长而混杂的核苷酸序列，里面有外显子和内含子。外显子通过特定基因的特定指令组成信息，但平时它们却被内含子隔开，散布在pre-RNA中，从而使遗传信息难以理解。因此，内含子必须被剪切掉，以便使外显子可以形成称为成熟mRNA的连贯信息链—这就是用于在细胞质中合成蛋白质的遗传密码。因此，RNA剪接的概念解释了为什么核mRNA比细胞质RNA长。

这些RNA剪接的证据是开创性的【1】，该结果1977年在PNAS上发表。

Weinberg说：“有些人非常接近发现剪接，但只是距离近还不够。您要么是发现了它，要么没有。Sharp做到了。”

在不了解真核RNA剪接之前，大家都有这样一个共识—所有生物都具有与细菌相同的基因结构—没有内含子。法国生物化学家Jacques Monod曾获得1965年诺贝尔生理学或医学奖，他著名的断言是，“在大肠杆菌发现的任何真实性也一定对大象具有同样的真实性”【7】。但是，RNA剪接表明，具有不连续基因的真核细胞比细菌要复杂得多。这也揭露了另一个教条的错误，即“一个基因产生一个mRNA，而所有来源于同一基因的mRNA产生一种蛋白质”。通过称为选择性剪接的过程，只需几个基因即可产生各种不同的蛋白质。与重新排列一组字母可以形成不同单词的方式类似，单个基因的外显子可以重新排序以生成多种蛋白质。

Sharp将发现RNA剪接与发现Rosetta Stone相提并论（18世纪末发现的刻有古埃及国王托勒密五世登基的诏书，印有三种文字，对于古埃及的象形文字研究非常重要）。他的发现为他赢得了1993年诺贝尔生理学或医学奖。

图3.（A）Phillip Sharp从瑞典国王卡尔十六世·古斯塔夫（King XVI Gustaf）获得1993年诺贝尔生理学或医学奖。（B）Richard Roberts荣获瑞典国王卡尔十六世·古斯塔夫（Kalf XVI Gustaf）颁发的1993年诺贝尔生理学或医学奖。

Sharp认为，“RNA剪接为世人所知只是时间问题。总会有人发现他。我们很幸运能做到这一点。”

Sharp仍然是MIT的教授，他对自己40多年前与Berget和Moore一起取得的成就感到敬畏。“有幸成为发现的一部分，它加深了我们的理解和帮助人们的能力，这是一种非同寻常的体验。”

与Sharp一起获得诺贝尔奖的分子生物学家Richard J. Roberts【8】，现在为New England Biolabs首席科学家。在CSHL期间，Roberts和他的同事Richard Gelinas将他们的研究重点放在了启动子上，即从基因开始转录成mRNA的DNA区域。他们专门研究了Adenovirus，以确定细菌和真核启动子是否具有相同的序列特征。

使Richard J. Roberts获得诺奖的文章，是独立地做出了同样的发现并将结果发表在1977年的Cell上的这篇论文【9】，该文章的第一作者是中国台湾籍华人周芷(Louise Chow)。

Roberts说，“如果真核基因与细菌基因相同，那就是实验给我们带来了不合理的结果。我们想到了用电镜进行实验的想法，该实验将阐明我们一直在进行的所有生物化学实验结果的疑惑。我们在周六早上设计了该实验；该实验是在周二上午由周芷做的，到周二下午，splicing的发现就被大家普遍接受。”

（以下是笔者观点。）

除了这篇论文外，周芷博士还在当年Cell杂志的前一卷（第11卷，引用9是发表在12卷）上发表了另一篇相关论文【10】，改论文作者分别是Louise T. Chow, James M. Roberts, James B. Lewis和Thomas R. Broker，周芷博士是第一作者，James M. Roberts并不是Richard J. Roberts，因此Richard J. Roberts根本没出现在作者名单中。当时也没有通讯作者，自然是第一作者贡献最大。同为引用9的参考文献，作者分别是Louise T. Chow, Richard E. Gelinas, Thomas R. Broker和Richard J. Roberts，其中周芷博士依然是第一作者，Richard J. Roberts虽然在最后的位置，但也并非通讯作者，这篇文章也没有通讯作者，自然也是第一作者的贡献最大。两篇重要的参考文献中，无论怎么考量也是周芷博士的贡献最大。

然而，1993年的诺贝尔奖却没有颁发给周芷博士，实在是令人疑惑不解。这不得不让人想到性别歧视和种族歧视。周芷博士为女性，当时身为华人的她虽然已经在美国工作28年，但是依然没有加入美国国籍。

也有一些其他传闻，据说当时诺奖委员会误以为Roberts是实验室主任，然而，其实那时候CSHL实验室没有主任，Roberts自然也不会是；作者list只不过是根据分工不同，按贡献从前往后排序而已。当然也有人认为，是后来的冷泉港实验室主任James Watson在推荐的时候只推荐了自己喜欢的Roberts，而没有推荐周芷博士，使得周芷博士没有机会获奖。

不管怎么说，这中间也反映出当时的一些需要注意的事情，就是作者的贡献需要在文中清晰列出，现在的文章都会有，然而那时的很多文章都没有。

事情又过去二十余年，诺贝尔奖评委也不总是那么绝对的公平和公正。类似的案例也不是仅此一例。但希望未来能避免此类低级“失误”，给所有人公平公正的待遇。

对于自己没有获奖的消息，周芷博士自然是表示失望，但是隔天一早还是进实验室继续工作。就如她自己的回应一样，“这已是难以挽回的事实，只有静待有心的科学史家去发现真相。”

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周芷院士简介：

周芷(Louise T. Chow)，1943年出生于湖南，父亲周德伟曾是湖南大学经济系教授，曾任民国时期财政关务署署长，后迁居于中国台湾接受教育。1965年获得“台湾大学”农业化学系学士学位。后赴美国求学，在Caltech生物化学系大师Norman Davidson教授门下（可以是说与Sharp师出同门），利用电子显微镜研究细菌和噬菌体溶原基因的结构，并于1973获得博士学位。1973-1975在UCSF医学院从事博士后研究，1975年加入CSHL研究噬菌体DNA的逆转录和腺病毒的转录和复制的基因调控。1976年升任为研究员，并发现了真核生物的基因不连续性。1977年升任为高级研究员，1979年升任终身资深科学家。1984年加入罗切斯特大学医学院，研究人类乳突病毒；1993年加入阿拉巴马大学医学院生化系，继续从事癌症、病毒等方向的研究。2012年，当选美国国家科学院外籍院士（在美国五十多年都没有加入美国国籍）；2014年，当选台湾“中央研究院”院士；2019年5月，受聘为河南大学“杰出人才”特聘教授。

Phillip Sharp教授简介：

Phillip Allen Sharp教授，1944年6月6日出生，是美国MIT的遗传学家和分子生物学家。因发现RNA剪接与Richard J. Roberts共同获得了1993年诺贝尔生理学或医学奖。他于1966年获得Union College学士学位，1969年获得University of Illinois博士学位。1969-1971年在Caltech从事博士后研究 (Norman Davidson教授门下) ，1971-1974在冷泉港先后担任博士后和高级研究助理科学家。1974年至今，在MIT先后担任助理教授、教授，癌症研究所的副主任、主任，生物系主任，McGovern研究所主任等职位。他已获得无数荣誉，除了诺贝尔奖外，还于1983年先后当选美国科学院和人文与艺术学院院士；1988年获得Lasker基础医学奖；1991年当选美国医学科学院院士和生理学会会士。此外，他还是多国科学院外籍院士，众多大学荣誉教授。

制版人：珂

参考文献

1. S. M. Berget, C. Moore, P. A. Sharp, Spliced segments at the 5′ terminus of adenovirus 2 late mRNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 3171–3175 (1977).

2. P. A. Sharp, M. T. Hsu, E. Otsubo, N. Davidson, Electron microscope heteroduplex studies of sequence relations among plasmids of Escherichia coli. I. Structure of F-prime factors. J. Mol. Biol. 71, 471–497 (1972).

3. P. A. Sharp, S. N. Cohen, N. Davidson, Electron microscope heteroduplex studies of sequence relations among plasmids of Escherichia coli. II. Structure of drug resistance (R) factors and F factors. J. Mol. Biol. 75, 235–255 (1973).

4. K. Danna, D. Nathans, Specific cleavage of simian virus 40 DNA by restriction endonuclease of Hemophilus influenzae. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 68, 2913–2917 (1971).

5. H. O. Smith, K. W. Wilcox, A restriction enzyme from Hemophilus influenzae. I. Purification and general properties. J. Mol. Biol. 51, 379–391 (1970).

6. T. J. Kelly, Jr, H. O. Smith, A restriction enzyme from Hemophilus influenzae. II. J. Mol. Biol. 51, 393–409 (1970).

7. H. C. Friedmann, From “butyribacterium” to “E. coli”: An essay on unity in biochemistry. Perspect. Biol. Med. 47, 47–66 (2004).

8. NobelPrize.org, The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1993. https://www.nobelprize.org/prizes/medicine/1993/summary/ . Accessed 25 September 2019.

9. L. T. Chow, R. E. Gelinas, T. R. Broker, R. J. Roberts, An amazing sequence arrangement at the 5′ ends of adenovirus 2 messenger RNA. Cell 12, 1–8 (1977). （这篇文章中R. J. Roberts并非通讯作者，只是挂名的四作而已）

10. Louise T. Chow, James M. Roberts, James B. Lewis and Thomas Ft. Broker, A Map of Cytoplasmic RNA Transcripts from Lytic Adenovirus Type 2, Determined by Electron Microscopy of RNA: DNA Hybrids. Cell 11, 819-836 (1977).（这篇文章的作者list中，R. J. Roberts既不是通讯，也不是共一作，而是名字都没有。其中的二作James M. Roberts与R. J. Roberts并不是同一人；R. J. Roberts仅仅在致谢中出现）。