Point：我们发现在酸性条件下重链（HC）C端区域的不稳定性，这导致切割和聚集。IgG4中HC的C端区域的Leu445在其酸诱导的断裂和随后的聚集中起关键作用。将HC C末端Leu445突变为IgG4_CDR-X中的Pro（IgG1中的相应残基）可显着减少片段化和聚集，而将Pro445突变为IgG1_CDR-X中的Leu可促进片段化和聚集。
IgG家族进一步分为四个亚类，即IgG1，IgG2，IgG3和IgG4，这是通过在其重链氨基酸序列恒定区中发现的微小差异确定的。IgG1是主要的Ig血清亚类，由于其强大的效应器功能和出色的稳定性而常用于治疗药物。尽管IgG4的稳定性不如IgG1，但它已成为癌症免疫治疗抗体的重要子类。 为了稳定IgG4分子，人们进行了许多蛋白质工程工作，例如通过S228P突变来稳定铰链区。
通过将IgG4残基点突变为IgG1骨架中相应残基的点，已广泛研究了这些Fc区残基对IgG4稳定性的影响。除铰链区外，IgG4的不稳定性主要被认为是由位于CH2域中的疏水基序引起的。认为IgG4中的Phe296与IgG1中的Tyr296等效，有助于IgG4中高度聚集。IgG4的CH3域中的R409K突变降低了其对低pH的敏感性，并抑制了聚集体的形成。但是，Fc中的其他突变（Q355R，E356D，M235L，E419Q和L445P）对IgG4稳定性几乎没有影响。除了单个氨基酸对IgG4稳定性的影响外，结构域之间的相互作用也很重要。当改变Fab与CH2的相互作用时，Fc稳定性显着降低。结果表明，与IgG1相比，两个HC上CH3域相互作用的变化导致IgG4中更多的聚集。
图1.IgG1和IgG4中CH1，铰链，CH2和CH3的序列比对。保守的残基显示为黑色。类似的残基以绿色显示。具有不同属性的残基以红色显示。IgG4铰链区中带有下划线的脯氨酸（P）残基是野生型IgG4中丝氨酸（S）的突变，可稳定位于铰链区的两个二硫键。氨基酸的编号基于EU编号系统。
酸诱导的IgG4_CDR-X片段化和聚集
在以相同程序纯化的各种生产批次的IgG4_CDR-X样品中观察到相同的HC质量损失。相反，通过ProA立即进行pH中和而纯化的样品质量并未显示出这种质量损失（表1，sample_2）。该57 Da的损失与C末端Gly446截短一致。在具有C末端裂解的样品中未发现亲和力损失（数据未显示），这表明C末端残基对抗原结合的影响非常有限或没有影响。这与其他报道一致，即C末端修饰不影响抗体功能。
L-甘氨酸抑制柠檬酸并促进酸诱导的C端断裂和IgG4_CDR-X的后续聚集
述实验表明，使用柠檬酸钠洗脱通过ProA柱纯化的IgG4_CDR-X具有预期的HC和LC序列（表1）。这证实了细胞培养不是IgG4_CDR-X中C末端Gly446裂解的原因。图2D，Gly446裂解的水平随孵育时间的增加而增加。孵育6小时后，100％的分子被Gly446裂解（图2）。另外，经过6小时的温育，可溶聚集体从8.6％增加到26％（通过SE-HPLC测定），观察到少量沉淀（不溶聚集体）。孵育1小时后，在所有HC上观察到除HC上的Gly446之外的其他裂解，并截短至Asn434（图2D）。孵育6小时后，约90％的蛋白质沉淀，可溶性聚集物增加至45.6％（图2D）。沉淀中的抗体均裂解了所有HC，大部分裂解于Gly446。相反，L-甘氨酸缓冲液在6小时的过程中未产生C端截短，聚集或沉淀孵育（图2C和2D）。这些数据表明，由于酸诱导的水解，IgG4_CDR-X经历了C末端切割，并且这些残基的丢失导致了更高的聚集水平，这表明HC C末端残基对于稳定抗体很重要。因此选择L-甘氨酸缓冲液用于产生IgG4_CDR-X。
图2.在不同缓冲液中酸性胁迫下，IgG4_CDR-X的SE-HPLC和MS分析。将纯化的IgG4_CDR-X样品（7.5 mg/ml在20 mM His 150 mM NaCl中，pH 6.0）缓冲液交换成三种不同的酸性（pH 3.5）缓冲液（20 mM柠檬酸钠，20 mM乙酸钠或20 mM L-甘氨酸）含有150 mM NaCl。在指定的缓冲液中将所有样品稀释至4.4 mg/mL。SE-HPLC用3.4 µL（15µg）的样品（乙酸钠或L-甘氨酸缓冲液）或17 µL（15µg）的样品进行柠檬酸盐缓冲液处理（由于蛋白质损失过多）。A）在0、0.5和6小时后，在柠檬酸钠缓冲液中加注的IgG4_CDR-X的堆叠SE-HPLC色谱图。B）在乙酸钠缓冲液中应激0、0.5和6小时的IgG4_CDR-X的堆叠SE-HPLC色谱图；C）在L-甘氨酸缓冲液中0和6小时的IgG4_CDR-X的SE-HPLC色谱图；D）通过A280确定的蛋白质损失汇总，通过SE-HPLC确定聚集，在0和6小时应力后在质量分析中检测到样品的C末端裂解。
由于柠檬酸钠的显着作用，我们选择了它来研究HC C末端裂解的pH依赖性。用100 mM柠檬酸盐在pH7.0、4.0和3.5下研究了pH依赖性。通过使用pH4.0和3.5的柠檬酸盐缓冲液从ProA柱上洗脱CHO表达的IgG4_CDR-X，在室温下孵育1小时，然后用1 M Tris中和，而对于pH7.0则使用洗脱液进行实验。立即中和，然后孵育。用MS分析样品，数据显示在图3中。在pH7.0下，未检测到Gly446裂解或蛋白质聚集增加。在pH4.0时，在25％的抗体上观察到Gly446裂解，未检测到其他类型的裂解。但是，在pH3.5下，孵育1小时后，更多的C末端氨基酸被截断，未发现完整的IgG4抗体。另外，观察到明显的沉淀。这些依赖于pH的裂解表明，C端的截短最有可能是由于酸诱导的水解，pH值低于3.5的柠檬酸盐缓冲液大大提高了C末端的裂解。
图3.解卷积的重链质谱图，显示IgG4_CDR-X的pH依赖的C末端裂解。A）中性pH，用100 mM柠檬酸盐缓冲液（pH 3.5）从ProA柱上洗脱蛋白，并立即中和；B）pH4.0，用100mM pH4.0的柠檬酸盐缓冲液从ProA柱上洗脱蛋白，然后在相同的缓冲液中保持1小时，然后中和。C）pH3.5，用100mM pH3.5的柠檬酸盐缓冲液从ProA柱上洗脱蛋白，然后在相同的缓冲液中保持1小时，然后中和。
IgG4_CDR-X重链上的点突变L445P显着减少了重链C末端的截短和抗体聚集
研究人员报告说，IgG4 HC的最后几个C末端残基对其稳定性影响有限或没有影响。确定通过差示扫描量热法（DSC）的SPR和Tm的亲和力，以评估由突变引起的潜在结构变化（表2）。与未突变的伴侣相比，在任一突变的IgG形式中均未观察到亲和力或Tm变化。两种IgG1的Tm比IgG4的Tm高约12℃，这与文献报道的差异是一致的。野生型和突变体之间可比的Tm和亲和力表明突变后无明显的结构变化。
野生型和突变型IgG1和IgG4 CDR-X IgG均在100 mM柠檬酸钠缓冲液中于pH3.5下经受低pH胁迫。通过MS和SE-HPLC分析在1小时和24小时采集的样品。聚集和蛋白质损失的数据总结在图4中，温育24小时后沉淀和上清液中抗体的裂解结果如表3所示。野生型IgG4在1小时内经历了完整的C端截短，并检测到以下裂解类型：HC丢失-NHYTQKSLSLSLGK，-HYTQKSLSLSLGK，-TQKSLSLSLGK或-KSLSLSLGK（图3）。相比之下，IgG4 L445P CDR-X突变体在24小时后有两个切割类型：Gly446（主要存在于沉淀物中）和-QKSLSLSLGK（存在于上清液和沉淀物中）。大约40％的IgG4 L445P CDR-X分子未发生切割（C端Lys除外），这表明Pro445在低pH值下可以稳定IgG4发挥重要作用。在使用IgG1构建体的实验中，在野生型IgG1_CDR-X中未观察到切割，而在IgG1 P445L CDR-X突变体中观察到了完整切割，在孵育24小时后仅检测到一个切割的HC类型（缺失-LSLSLGK） 。
图4.酸性胁迫后，IgG4_CDR-X，IgG1_CDR-X及其突变体IgG4_CDR-X（L445P），IgG1_CDR-X（P445L）的SE-HPLC单体峰变化和蛋白质损失。将纯化的蛋白质缓冲液交换到pH值为100的100 mM柠檬酸盐缓冲液中，并在室温下孵育1和24小时，然后中和。A）T0，T1 hr和T24 hr的SE-HPLC叠加色谱图; B）SE-HPLC单体峰面积变化；C）通过A280测量的蛋白质损失。
孵育24小时后，在一些样品中观察到了通过沉淀造成的蛋白质损失（图4C）。两个IgG4 CDR-X构建体经历了明显的质量损失（野生型为42％，IgG4 L445P为22％），而IgG1和IgG1 P445L CDR-X突变体样品中没有明显的质量损失。通过SEC评估的上清液中的可溶性聚集体显示，在胁迫的24小时内，IgG野生型和IgG4 L445P CDR-X突变体均增加（图4A），但聚集体百分比有所变化（图4B，主要峰面积变化）。在IgG1 P445L CDR-X突变体中发现了片段。与野生型IgG4_CDR-X相比，IgG4 L445P CDR-X突变体的聚集体形成减少约50％。与野生型IgG1_CDR-X相比，IgG1 P445L CDR-X突变体的单体减少了约55％。这些数据说明了野生型和突变IgG稳定性的明显差异，表明Leu445是导致酸性条件下IgG4 Fc不稳定性的关键因素。将L445突变为P，即IgG1 C端的相应残基，可通过显着减少酸性条件下的裂解和聚集，显着提高IgG4的稳定性。
Fab和Fc之间可能的相互作用影响IgG4 Fc的稳定性
应激24小时后，IgG4_CDR-Y和IgG4_CDR-Z的可溶性聚集均增加至〜12％，与IgG4_CDR-X中的16.1％聚集相当。但是，IgG4_CDR-Y和IgG4_CDR-Z的沉淀可以忽略不计，而IgG4_CDR-X的蛋白质损失为37.4％（表4）。随后对IgG4_CDR-Y和IgG4_CDR-Z的质量分析表明，在低pH胁迫下不会发生C末端截短。由于CDR序列是这三种IgG4抗体之间的唯一差异，因此重链C末端裂解的不同行为以及随后的抗体聚集/沉淀表明CDR序列在Fc稳定性中起作用，并可能表明Fab与CH2-CH3域的潜在相互作用。
靶标结合是用于评估Fab对Fc稳定性的潜在影响的另一种方法。将相同的酸性实验与单独的IgG4_CDR-X并行应用于IgG4_CDR-X及其靶标的复合物（表5）。没有观察到复合物的沉淀，但是对于单独的抗体却观察到了蛋白质损失37.4％（表4）。在低pH值暴露24小时后，该复合物的可溶性聚集体的含量为28.7％。质谱分析表明，仅45％的HC在4小时后在Ser440之前的位点被裂解（裂解的肽-SLSLSLGK）。没有观察到另外的切割位点。24小时后，未切割的HC仍高于10％，而100％的IgG4_CDR-X分子在1小时内和多个切割位点被切割。该复合物对酸诱导的水解的抗性表明Fab对CH2 -CH3结构域的潜在稳定作用。
讨论 Leu445的酰胺化是酶促过程，仅在CHO表达阶段发生。我们在有和没有低pH保持条件下的结果表明，表达后发生了质量损失。裂解可能是由于酸诱导的水解，因为样品之间的主要区别是使用低pH保持。最值得注意的突变体是S228P和R409K，它们分别稳定铰链区并减少聚集。但是，这些研究都表明，重链C末端残基对IgG4的稳定性和功能几乎没有影响。将Leu445突变为IgG4_CDR-X中的Pro（IgG1中的相应残基）可以显着提高IgG4的稳定性。相反，在IgG1_CDR-X中将Pro445突变为Leu会降低IgG1的稳定性，这表明Pro可能在稳定IgG4重链中起重要作用。这些数据表明，重链C末端的切割受IgG的CDR序列影响，因此表明Fab对CH2-CH3结构域的稳定性有潜在的影响。此外，抗原结合显着改善了IgG4_CDR-X的稳定性。这些结果表明，IgG4 HC的C端稳定性受CDR序列和Fab构象的影响。
参考文献：Chang-Ai Xu, Andrew Z. Feng, Charan K. Ramineni,(2019): L445P mutation on heavy chain stabilizes IgG4 under acidic conditions, mAbs
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