IgG4抗体药物
已批准的80多个含IgGFc生物药品中（70多个mAb，10多个Fc融合蛋白），58个为IgG1,15个为IgG4.
一度认为IgG4不能结合FcR，不引起ADCC，也不能引起CDC效应。后续的研究发现，虽然结合力低于IgG1，但是IgG4依然可以结合FcγRI，FcγRIIB, FcγRIIC, FcγRIIIA, 尤其 V158 同种异型抗免疫球蛋白。
使用IgG4亚型不一定能够确保不引起免疫激活效应，因为交联FcγRIIB是细胞因子风暴的关键。TGN1412 (anti-CD28superagonist IgG4) Phase 1临床遇到细胞因子风暴的问题
IgG1和IgG4的药物上的差异，是重链γ1和γ4。这些差异主要集中在铰链内部和周围，在生物生产过程中也会影响下游工艺。例如，纯化过程可能有助于聚合，但根据亚型，程度不同。事实上，在低pH条件下，IgG 4的稳定性不如IgG 1。
γ4第228位丝氨酸是IgG4s稳定的关键氨基酸。
15种已批准IgG4抗体中，12种在其恒定重链中被修改，而在50种已批准的IgG1基疗法中只有14种含有恒定的重链修饰。此外，目前处于PhaseIII的大多数IgG4抗体都具有恒定的重链修饰。
下表为IgG4抗体及其Fc段修饰情况
本文梳理IgG4恒定重链的改造专利，有助于了解其对于IgG4抗体药物开发的意义。
IgG4抗体重链改造专利
降低IgG效应功能
1989年哥伦比亚大学提出了第一个专利申请(WO8907142)。其想法是交换不同IgG亚类的结构域，以获得具有所需特性的抗体。尽管在1996年获得了一项欧洲专利，但Celltech提出了反对意见，该专利最终在2006年被撤销。
第一份申请(WO9428027)是由Arch Development Corporation于1993年提出的，该申请声称IgG4(以L235E突变)处于沉默状态。然而，美国和欧洲的专利声称是相当限制性的，因为他们指的是带有这种突变的抗CD3抗体，而不是任何有这种突变的抗体。
其他专利(WO9429351，WO9526403)包含带有突变的IgG4变异体(L235A、F234A或G237A)。然而，没有发现涉及IgG的广泛要求的专利，在任何一个位置都包含一个突变，以废除效应功能。Celltech在1994年提出了一项申请(WO9526403)，对减少补体激活提出了广泛申请，但没有获得专利。
2000年，Genentech提交了一份申请(WO200042072)，其中包含了数百个单一的变体，后来获得了数十项专利。这些专利与FcyR结合增强有关，但它们也包含减少与所有FcyR结合的突变的例子，例如D265A，这是家族中一项专利(US 7332581)所涵盖，这些专利将于2020年到期。
2003年，Xencor在WO2004029207中提出了几项申请，其中包括数百个调节与FCγR亲和力的FC变异体，他们获得了美国专利，例如L328替代减少ADCC，或A330R突变减少与FCγRIIIA的结合。有人反对，包括涵盖F243L突变的EP2364996B1专利。
从20世纪90年代初到21世纪初，出版物和专利申请揭示了大多数有趣的单一突变降低效应功能。因此，公司正在寻求专利突变组合，以自由开发自己的沉默mAb。
Alexion开发了一种废除效应功能的技术，将IgG2(T260)与IgG4Fc末端连接，产生了一个与C1q和FCγ受体结合非常弱的分子。
这是抗C5市场上销售的抗体的格式，依库珠单抗eculizumab(Soliris)和依库丽单抗raulizumab(ULTOMIRIS)。Alexion撤回了他们2005年的申请(WO2005007809
）。这种模式(尽管不包括在专利范围内)还没有被其他公司所使用，至少在临床开发中还没有被用于mAb(生物相似剂除外)。
挪威科学技术大学申请的WO2015140591和Centocor 申请的WO2011066501。在后者中，它最初是一种基于IgG 2的格式，有IgG4点突变，Janssen(前Centocor)最终从同一个WO2011066501专利家族获得了一个变异IgG4(S228P、F234A、L235A、G237A和P238S)的专利(US 10053513B2)。
2011年，默克申请WO2011149999描述了由F243A/V264A突变组合组成的唾液化Fc多肽。如果这些突变导致Fcγ受体与IgG 4框架的结合减少，则这些突变可能是有用的。
IgG4突变L234A和L235A，通过阻断FC/FCγ受体界面内的一个夹心脯氨酸基序，进一步降低效应功能。葛兰素史克2016年申请专利WO2017079369，描述了新的IgG2Fc和IgG4Fc突变组合，特别是针对IgG 4的E233P/F234A/L235A/G236del/G237A突变组合。
延长IgG4半衰期相关的突变
半衰期对于任何用于治疗的IgG亚类都是至关重要的，因为它的延长可以帮助减少剂量或给药间隔。
Genentech是第一批申请专利的人之一，其基因突变可以增强人类抗体与FcRn的结合。他们从WO200042072专利家族获得了三项专利，涉及307、380和434位点。例如，N434A、N434H或T307A/E380A/N434A改善了动物模型的半衰期，其中N434A可能是最好的变体。然而，434位突变的专利只涵盖IgG1，并被认为在2020年到期。
另一个先驱，Medimmune(现在的阿斯利康)，2001年从WO02060919申请家族获得了一项美国专利(US 7083784)，并提出了广泛权益，涉及252/254/256/309/311/433/434/436位点的修改。该专利涵盖了著名的M252Y/S254T/T256E(YTE)突变组合，该突变组合可使猴的血清抗体半衰期增加近4倍，并使motavizumab在人类体内的半衰期延长至100天。该家族还授予了其他七项专利，将保护范围扩大到位于或接近Fc/FcRn接口的其他突变组合(308/311/385/386/389/428).欧洲专利是不同的，因为EP1355919B1专利的主要要求保护的是单一252位(Y、F、W、T修改)，EP2354149B1专利的主要保护433K/434F/436H组合，2022年到期。
从WO2004035752专利家族中，Abbott被授予美国和欧洲两项专利，其中包括T250Q/E和M428L/F替换抗体。不同亚类和不同CDR的抗体，包括突变组合T250Q/M428L(QL)，在恒河猕猴中表现出近2倍的IgG半衰期增强。
Xencor拥有多个广泛专利，包括美国和欧洲的专利：1)N434S、308 W、308 Y和308 F突变(WO2006053301家族，2026年到期)；2)M252Y/M428L和D259I/V308F组合(WO2009058492)；3)著名的M428L/N434S(LS)突变组合(WO2009086320)，据报在人类中有4倍的延长半衰期(将于2028年到期)。Xencor的专利组合还包括T307Q/N434S、M428L/V308F和Q311V/N434S组合专利。
2009年，LFB获得美国专利(WO2010106180)，涉及12个突变组合，增强FcRn结合。令人惊讶的是，Fc/FcRn界面上没有几个突变，但其中一些突变，例如228和230位置的脯氨酸，可能会对FcRn结合位点产生遥远的影响。
2009年，Genentech提出了一项专利申请(WO2010045193)，以保护先前的申请中已经描述的位置的突变组合，特别是由T307Q/N434A突变组成的组合，它导致了25天半衰期。尽管被质申请疑新颖性，但美国和欧洲的申请尚未被放弃。
其他组织试图申请不同的Fc突变，以增强与FcRn的结合，例如2013年的BioAtla(WO2013163630)。发布了几个不同突变，例如(US 20180186863)申请中的E258F/V427T突变组合。然而，在其他申请中并没有描述它们的突变体；示例部分只指出，与野生型Fc和中性pH下的正常结合相比，在酸性pH条件下，被测变异体的FcRn结合量为2~80倍。挪威奥斯陆大学(WO2017158426)、Kookmin大学(KR101792191多个申请)和MacroGenics(US20190010243)也发现了性能增强的新变种。例如，Visterra 40(WO2018052556)设计了具有增强半衰期的新变体，同时保留了良好的效应功能(尽管这一特性与阻断抗体无关)。
通过用带正电荷的氨基酸代替带负电荷的氨基酸，降低等电点，降低血清半衰期。例如，中外制药获得了一项广泛的欧洲专利(EP 2006381)，该专利涉及通过改变等电点的可变区域的任何修改来调节血清半衰期。Alexion和其他人一起反对这项专利，中外制药的专利最终被撤销，但中外制药对这一决定提出了上诉。
从WO2016227母体申请中，Xencor还拥有一项欧盟(EP3029066)和两项美国专利(US 8697641和US9605061)，涉及恒定区域的等电点修改，但它们仅限于特定的突变组合。其他申请，如最近发布的US 0180222965，声称突变组合调制半衰期，但现在还不能确定这些声明是否会被维护。
与稳定和下游工艺相关的突变
S228P突变解决了IgG4稳定性问题
Celltech的研究人员在1992发表的文献表明，在IgG4以外的所有IgG亚类中都有一个S228P替换(脯氨酸存在于此位置)，足以消除人IgG4抗体的异质性。1994年，Celltech公司提出了一项针对E-选择素抗体的专利申请(WO9526403)，其中包括降低效应功能的L235E替代和废除半抗体分子形成的S228P替代。然而，这种众所周知的突变从未得到过保护.事实上，我们并没有发现任何包含任何IgG4 mAb的S228P替代抗体药物的专利。
然而，这一发现对IgG4衍生抗体的发展产生了重大影响。这种突变几乎总是包含在新开发的IgG4抗体中。例如，开发了tabalumab (anti-BAFF)或relatlimab (anti-LAG-3)的公司已经计划纳入这种突变，因为他们的专利声称或提到了S228P作为该发明的一个体现。这种突变解决了IgG 4稳定性的主要问题。
2006年，IgG4稳定专利转移到CH3，通过突变R409来解决IgG4在低pH条件下聚集的问题(WO2006033386)。在示例部分，他们表明S228P/L235E/R409K变异体在低pH条件下比S228P/L235E变异体表现出较少的聚集倾向。美国和欧洲的专利都被授予了关于抑制IgG4聚集的突变组合的广泛权益。
Genmab申请(WO2008145142)，描述了一个相同的突变减少了Fab-Arm的交换，但是他们欧洲专利遭到反对，主要是因为之前协和麒麟的专利。Genmab的专利保持不变，尽管经过了修正，因为它在权益声明中提到了枢纽区域，而且区分了Fab-ARM交换现象和聚合过程。反对者承认，新的和创造性的一步是Genmab的证明，409单突变(S228P不一定必需)可以减少Fab臂交换。
一年后，Genmab对其他稳定替代品的申请(WO2010063785)，例如K370Q/E(以及其他)，都获得了美国和欧洲的专利。2016年，他们还提交了一份申请(US2017029521)，要求在370位置进行任何突变，但仅限于由CXPC或CPXC(非S228P)序列组成的多肽铰链区域。
各公司已经考虑使用这一格式进行进一步的发展。例如专利申请WO2018127586A1的示例部分，ElsalysBiotech测试了该突变组合的抗CD160单抗。其他公司，Calypso在其EP2985295A1专利申请中考虑了这种格式，涉及到它们的anti-MMP 9 mAb。
2010年，Biogen提出专利申请(WO2010085682)，该技术涉及IgG 1 CH3结构域的琼脂化、稳定IgG4。他们的想法是构建一种具有大量突变的沉默的IgG，以减少由酰基化引起的热稳定性损失。他们描述了许多突变，例如297、299、307、309、399、409和427位点突变，以及与疏水斑块中大量疏水氨基酸相关的valine替换(在240、262、264和266中)。然而，他们撤回了申请。
S228P并不是唯一既能调节二硫键形成又能稳定分子的突变。2010年，UCB提出了一项申请(WO2012022982)，并获得了任何IgG4的欧洲专利，在131位的任何氨基酸替换为上铰链中的半胱氨酸。除了S228P突变外，他们还产生了大量的IgG4变异体，Fab热稳定性增强，产品异质性降低。然而，与唯一的S228P突变相比，尚不清楚这些新的突变是否具有真正的优势。
中外制药获得WO2009041613家族的欧洲专利，包括删除G446和K447，减少IgG4C末端异质性。根据他们的序列列表和他们的主张，这种保护适用于任何具有S228P突变的IgG4。尽管中外制药通过删除G446和K447氨基酸而具有降低C端异质性的专利，但仅K447的缺失已被用于一些抗体中，如blosozumab (anti-sclerostin),dupilumab (Dupixent®, anti-IL-4Rα), emibetuzumab (anti-cMet), ixekizumab (Taltz®, anti-IL-17)。光是这种突变似乎不被任何专利所涵盖。根据中外制药专利WO2009041613的说法，与唯一的K447缺失相比，它的双重缺失可以进一步降低异质性。
根据Bristol-Myers Squibb在2017年提交的WO2018119380申请，S228P稳定的IgG4会导致不良的生物分析和生物加工行为。在示例部分，他们发现S228PIgG4在CEX-HPLC上可能是以双峰形式逃逸，可能是由柱内的两种结合构象引起的。为了限制这种行为，在重链中引入了突变。主要在196位任何其他氨基酸取代赖氨酸，或在217/220/(224或225)个位置替换赖氨酸。
此外，Tran等人。在2017年，IgG 4比IgG 1更容易与磷脂酶B样宿主细胞蛋白结合，葛兰素史克公司提交了一份申请(WO2018065389)，涵盖重链(更具体地说是与铰链区)的突变，从而取消了与该蛋白的结合，更广泛地说是与宿主细胞蛋白的结合。这个应用程序还处于早期阶段，而且不太可能获得非常广泛的主要要求，因为许多文档都对新颖性提出了质疑。
结语
IgG4抗体药物，通过重链改造，降低ADCC及补体效应，增强和FcRn结合从而获得更好的半衰期，此外S228P等的突变，增强了IgG4的稳定。因而IgG4抗体的开发，应该注重重链改造，以获得更好的药物作用。
专利侵权如何规避，相信各家大厂都有自己的见解。是否可以探索出新的突变位点或者组合，是未来取的主动权的基础。相信有预见性的企业会加大抗体基础结构研究。
参考文献：Christophe Dumet，Insights into the IgG heavy chain engineering patent landscape as applied to IgG4 antibody development，MABS，2019。
aEA7501, Team ”Fc Receptors, Antibodies and Microenvironnement”, Université de Tours, France; bCHRU de Tours, France
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