非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）影响全球30%的人群，并与肥胖、胰岛素抵抗和代谢综合征高度相关[1]。NAFLD的主要定义特征是肝脏甘油三酯蓄积超过肝脏体积的5%或超过肝脏重量的5%[2]。既往研究表明，膳食钙补充可以缓解NAFLD，但其作用机制尚不清楚[3]。本期研究旨在探讨钙对肝脏脂质代谢的影响[4]。 研究方法 8周龄雄性C57BL/6J小鼠被分为四组（每组6只）：（1）小鼠喂食含0.5%钙（CN0.5）的正常食物，（2）小鼠喂食含1.2%钙（CN1.2）的正常食物，（3）小鼠喂食含0.5%钙的高脂饮食（HFD）（HFD0.5），（4）小鼠喂食含1.2%钙的HFD（HFD1.2）。此外，为了了解潜在的机制，研究者采用油酸和棕榈酸处理细胞以模拟体外HFD条件。 研究结果 为了检测钙的毒性，研究者在不同的钙浓度下测定细胞活性。结果表明，与正常钙水平（2 mmol/L）相比，0 mmol/L和3.5 mmol/L钙对HepG2细胞具有毒性（图1A）。因此，在接下来的研究中，研究者分别加入了1 mmol/L和3 mmol/L的钙来代表低水平和高水平的钙。在OA/PA（油酸200 μM/棕榈酸100 μM）处理后，HepG2细胞中甘油三酯（TGs）减少（图1B）。细胞外TG水平没有改变（图1C）。HepG2的油红O染色显示高钙处理后脂滴数量显著减少（图1D）。在原代肝细胞中，钙补充剂也减少了OA/PA诱导的TG积累（图1E）。在AML12细胞中，研究者发现高钙对减少TG具有相同的作用，但与HepG2细胞不同，低钙处理没有减少甘油三酯（图1F）。此外，研究者发现高钙处理后脂肪酸合成相关和水解相关基因的表达没有显著变化（图1G-H）。研究者还检测了脂质转运基因微粒体甘油三酯转移蛋白（MTTP）和载脂蛋白B（APOB），结果发现它们在高钙水平下有所降低，但差异不显著（图1I）。
钙补充剂可减少HepG2细胞中甘油三酯的积累
图1.钙影响HepG2细胞中甘油三酯的积累
（引自发表文章）
钙缓解高脂饮食诱导的肝脂肪变性
在用四种不同的饮食喂养8周后，高脂饮食组（HFD组）小鼠的体重显著高于对照组（CN组），但高钙组和正常钙组之间没有显著差异（CN0.5 vs. CN1.2或HFD0.5 vs. HFD1.2；图2A）。喂食实验8周后，研究者使用microCT分析法（LCT-200）测量小鼠的脂肪和瘦肉量。HFD组的总脂肪比例显著高于CN组（图2B）。HFD0.5组和HFD1.2组之间没有显著差异。内脏脂肪的比率趋势与总脂肪比率趋势相同（图2C）。所有组之间的棕色脂肪没有显著差异，但在高脂肪饮食中，钙有增加棕色脂肪的趋势（图2D）。在肝脂比方面，HFD组高于CN组。然而，高钙显著降低HFD诱导的肝脏脂肪积累（图2E）。
在用HFD和高钙治疗小鼠后，研究者测量了小鼠肝脏中的TGs。在HFD组，高钙显著降低肝脏TGs（图2F和G）。此外，HFD1.2组的血浆钙水平显著高于HFD0.5组（图2H）。CN组的血糖低于HFD组（图2I）。此外，HFD组的附睾脂肪高于CN组，但HFD1.2组的附睾脂肪低于HFD0.5组（图2J）。研究者还收集了这些小鼠的粪便，发现HFD1.2组的粪便TGs显著高于HFD0.5组（图2K）。相关性分析表明，在HFD0.5和HFD1.2组中，血钙水平与肝脏TG水平和附睾脂肪重量/体重呈负相关，与粪便TG水平呈显著正相关。这表明钙与肠道脂肪吸收有关。随后，检测基因表达。高钙处理后，除HSL外，对照组和高脂组的大多数基因变化相似（图2L-M）。
图2.钙对体内脂肪积累的影响
（引自发表文章）
钙增加葡萄糖摄取并减少糖酵解
研究者测试了HepG2细胞和小鼠肝脏中的糖原含量，发现高钙显著增加了糖原的积累（图3A和B）。接下来，研究者使用Seahorse检测OA/PA条件下高钙治疗期间的细胞外酸化率（ECAR）（图3C）。量化数据后，发现高钙显著减少非糖酵解酸化（图3D）和糖酵解（图3E）。而糖酵解力没有显著变化（图3F）。高钙增加了细胞糖酵解储备的速率（图3G）。为了进一步了解钙对肝细胞糖代谢的影响，研究者检测了糖异生的关键酶活性。钙显著降低葡萄糖6磷酸酶（G6P）和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）的活性（图3H和I）。用葡萄糖类似物染料2-NBDG处理细胞后，发现钙促进葡萄糖的吸收（图3J）。研究者检测了Glut2的mRNA和蛋白质水平。补钙治疗后，Glut2在mRNA水平上呈上升趋势（图3K），但在蛋白质水平上没有变化（图3L和M）。此外，肝脏中AKT和p-AKT的表达水平没有变化（图3L和M）。这些结果表明，钙增加了肝细胞的糖原储存和葡萄糖吸收，同时减少了糖酵解和糖异生途径。
图3.高钙对葡萄糖代谢的影响
（引自发表文章）
钙对线粒体能量代谢的影响
研究者检测了未经OA/PA处理的HepG2细胞的耗氧率（OCR）（图4A）。量化数据后，研究者发现钙不影响细胞的基础呼吸、最大呼吸、质子泄漏、ATP产生或耦合效率（图4B-F）。然后，对经OA/PA处理的细胞进行相同的试验（图4G）。量化后，数据显示钙显著降低了基础呼吸和最大呼吸（图4H和I）。此外，质子泄漏和ATP生成有明显的下降趋势（图4J和K）。然而，钙对耦合效率的影响并不明显（图4L）。为了进一步验证钙对HepG2细胞能量水平的影响，在OA/PA处理条件下测量ATP水平。结果表明，钙显著降低ATP水平（图4M）。上述结果表明，钙降低了线粒体能量代谢和细胞ATP水平。
图4.高钙对OA/PA诱导能量代谢的影响
（引自发表文章）
补钙增加线粒体和细胞质中的钙水平
为了进一步研究钙如何影响肝细胞中甘油三酯的积累，研究者检测了细胞质、内质网和线粒体中的钙水平。补钙显著增加线粒体和细胞质中的钙水平（图5A），并降低MCU的mRNA表达（图5B）。因此，研究者选择MCU的特异性抑制剂Ru360和米托蒽醌治疗HepG2细胞并测定其细胞毒性。结果表明，10 nmol/L Ru360和米托蒽醌对细胞没有毒性（图5C和D）。Ru360和米托蒽醌均能显著降低线粒体中的钙水平（图5E和F）。而它们都对甘油三酯水平没有任何影响（图5G）。为了进一步验证这一结果，研究者使用MCU特异性siRNA来抑制MCU表达（图H-J），结果发现MCU抑制显著降低线粒体中的钙水平，但不影响钙对甘油三酯积累的影响（图5K和L）。
图5.高钙对细胞内钙水平的影响
（引自发表文章）
补钙促进脂肪酶活性
随后，研究者想要恢复细胞质钙水平以研究钙的作用。为此，用0.1 μmol/L BAPTA（钙螯合剂）处理细胞。如预期，钙螯合作用阻止了钙对脂肪代谢的影响，并增加了脂肪积累（图6A）。BAPTA不仅降低细胞质中的钙水平，而且降低了线粒体中的钙水平（图6B）。这表明降低细胞质和线粒体中的钙水平可以消除高钙对细胞内TGs积累的影响。这些结果表明，钙可以通过作用于细胞质来减少甘油三酯的积累。脂肪含量会受到脂肪合成和降解影响，因此，研究者首先测试了HepG2细胞中脂肪酸（FA）的吸收和小鼠血清中游离脂肪酸（FFA）的水平。结果表明，钙对细胞FA吸收和血清FFA没有显著影响（图6C和D）。紧接着，研究者测量了甘油水平以评估甘油三酯水解状态，数据显示，钙显著增加了细胞内甘油水平，但对细胞外甘油没有显著影响（图6E和F）。对脂肪酶活性进行测试，结果表明钙显著促进HepG2细胞和肝脏中的脂肪酶活性（图6G和H）。随后，研究者检测了HepG2细胞中线粒体膜蛋白和氧化还原相关蛋白的表达水平（图6I）。钙对线粒体膜蛋白的表达没有显著影响（图6J），但显著降低了线粒体编码的细胞色素c氧化酶亚单位1（MT-CO1）的表达（图6K）。这些数据表明，钙通过影响脂肪酶活性调节脂肪积累。
图6.钙对脂肪吸收和分解的影响
（引自发表文章）
综上所述，该研究的发现为缓解NAFLD提供了一种可能的方法。膳食补钙可以有效地减少外源性脂肪的摄入和肝脏中甘油三酯的积累。这为今后钙与脂质代谢关系的研究提供了新的方向。
参考文献：（可上下滑动查看）
1.Lazo M, Clark JM. The epidemiology of nonalcoholic fatty liver disease: a global perspective. Seminars in liver disease, 2008, 28: 339-350.
2.Kleiner DE, Brunt EM, Van Natta M, et al. Design and validation of a histological scoring system for nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology, 2005, 41: 1313-1321.
3.Nadeem Aslam M, Bassis CM, Zhang L, et al. Calcium Reduces Liver Injury in Mice on a High-Fat Diet: Alterations in Microbial and Bile Acid Profiles. PloS one, 2016, 11: e0166178.
4.Zhang Z, Liu S, Qi Y, et al. Calcium supplementation relieves high-fat diet-induced liver steatosis by reducing energy metabolism and promoting lipolysis. J Nutr Biochem, 2021, 94: 108645.
（来源：《国际肝病》编辑部）
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