常规HE染色不同染色系统的评分分析

近年来，随着科技的发展，我国常规病理诊断中HE染色技术得到不断的改良，滴染式染色方法的出现对传统浸染模式提出挑战，与此同时，对于步骤繁琐的浸染程序进行精简的改良浸染模式也应运而生。我们从染色结果、染色均一性及有无交叉污染等方面，探讨3种染色体系的差异。

一、材料与方法

1.材料

　　收集北京协和医院2014年5—12月经4%中性缓冲甲醛液固定的手术标本10例，分别来源于皮肤、乳腺、胃、肠、肺、肝、肾、脑、淋巴结和甲状腺的常规病理组织。本组病例的入选标准是（必须符合所有标准）：（1）病理学确诊为正常或肿瘤组织；（2）能够获得足够组织标本；（3）样本是外检诊断后剩余的组织样本；（4）样本采用4%中性甲醛固定液，且符合临床试验相关要求。每例经石蜡包埋后，获得4 μm连续切片22张，分为11个染色单元，每个染色单元含10张不同组织来源的切片。

　　2.仪器及试剂

　　VIP6全自动组织脱水机（购自日本樱花公司），RM2235轮转式石蜡切片机（购自德国徕卡公司），传统浸染法使用染色仪器为Autostainer XL自动染色机（购自德国徕卡公司），染色试剂为环保染色套液（北京九州柏林生物科技有限公司）；改良浸染法使用Coverstainer全自动HE染色封片机，染色试剂为机型推荐试剂（购自丹麦Dako公司）；滴染法使用Symphony全自动高清晰单独滴染式HE染色平台，染色试剂为机型推荐试剂（购自瑞士Roche公司）。其余试剂均为国产分析纯。

　　3.分组

　　按照不同染色方法对染色切片分组，其中A组为改良浸染法＋进行性染色，“浸泡”染色，在整个染色过程中所有试剂循环流动＋Mayer苏木精；B组使用传统浸染法＋退行性染色，“浸泡”染色，在整个染色过程中除水以外的所有试剂静止＋Harris苏木精；C组使用单张切片每次使用新鲜试剂的滴染法＋Harris苏木精。根据机型选择推荐染色程序。根据不同仪器推荐的最大染色切片负荷量，A组切片染色数量为3 000张，B组为1 500张，C组为700张。在每组切片的最小、半数最大、最大试剂负荷染色单元中进行抽样，未抽取的切片范围由相同组织大小的非测试组织补齐染色所需的数量。

　　4.染色评分

　　对各组抽样切片的染色质量进行双盲评分。采用随机数字的方法在病理诊断医师库里抽取5名医师针对染色质量进行评分。首先评判染色质量是否符合诊断要求，如不符则切片得分为0分；染色质量如符合诊断要求，根据细胞核、细胞质染色以及交叉污染的评分标准[1,2]进行判读评分，3项的满分分别是9分、9分和6分，总和为该切片的得分。

　　5.统计学方法

　　数据结果以均值±标准误表示，数据的处理采用GraphPad Prism 5.0软件，评分的比较采用方差分析。以P<>

二、结果

从染色均一性分析，A组最小试剂负荷染色切片评分值为23.56±0.09，最大试剂负荷（1 000 mL）染色切片评分值为23.08±0.16，差异无统计学意义。B组最小试剂负荷染色和最大试剂负荷（500 mL）染色的评分值分别为23.12±0.16和22.36±0.23，差异有统计学意义（P<0.05）。c组最小试剂负荷染色和最大试剂负荷（700>

　　从染色质量分析，比较3组的最小、半数最大、最大试剂负荷量/规格用量染色评分结果（图1，图2，图3）发现，仅在最大试剂负荷量染色切片中，A组评分值（23.08±0.16）明显高于B组（22.36±0.23），差异有统计学意义（P<>

图1～3A、B、C组试剂分别在染液最小、半数最大以及最大试剂负荷时的染色效果 HE 低倍放大

　　图1A，1B，1C 分别为A组最小、半数最大及最大试剂负荷时的染色效果

　　图2A，2B，2C 分别为B组最小、半数最大及最大试剂负荷时的染色效果

　　图3A，3B，3C 分别为C组最小、半数最大及最大试剂负荷时的染色效果

　　从交叉污染指标分析，A、B、C组最大试剂负荷量/规格用量染色切片的交叉污染评分分别为2.98±0.02、2.88±0.07和2.90±0.04，差异无统计学意义。

三、讨论

在常规HE染色中，病理科一直沿用传统浸染式的染色方法，该方法使用的Harris苏木精[3]是一种全氧化苏木精，染色后需经分化，属于退行性染色。我们提及的染色系统A使用的是改良Mayer苏木精为主的进行性染色，不需盐酸乙醇分化[4]，其他试剂相同。从结果上看，2种苏木精的染色效果均可满足日常诊断的需要。

　　目前，HE染色平台主要分为浸染式和滴染式2种，后者与传统的浸染法操作相比，避免了标本与标本、标本与试剂之间的相互污染[5,6,7]。组织切片在染色中发生标本脱落，很大程度上是由于烤片时间不足、标本固定不良或蛋白凝固变性不佳等造成蜡片与玻片黏附不良。在本组实验中，所选的测试组织均为固定良好的标本，且严格按照推荐的烤片时间进行操作，3组染色系统均未发现标本相互污染的现象，这一结果低于Cahill和Pearson[5]的研究结果，说明在浸染过程中出现的标本之间的污染是可以避免的。苏木精的试剂污染现象主要是由于过度氧化造成的。Harris苏木精在使用过程中的过度氧化易出现金属样氧化膜浮在液面和容器壁上，引起切片污染。而改良的Mayer苏木精在氧化过程中呈均匀反应，无氧化膜形成，所以也避免了对切片的试剂污染[8]。在我们的实验中，在保证Harris苏木精每天使用前及时清理金属膜的前提下，使用浸染式的A和B组染色系统未出现明显的试剂交叉污染现象。

　　在当前病理技术发展过程中，质量控制不仅是为了满足诊断的需要，更是为了达到每张切片染色均一的效果[2,9]。滴染式染色由于每一张HE制片都是采用同样的试剂单独染色，能够保证每张切片使用新鲜试剂，因此切片的染色均一。我们也比较了浸染系统组内的染色均一性，在试剂保持静止状态的传统浸染染色系统组内，染色均一性较差。而改良浸染式由于所有试剂是“流动”的，同时配有过滤装置，能够有效过滤沉渣和“漂浮物”，提高试剂的使用效率，在一定程度上保证试剂的相对新鲜，因此染色的均一性较好。

　　综上所述，使用改良浸染法的染色平台系统，不仅能够保证染色的质量和均一性，而且能在完成的染色切片数量上更胜一筹，适合批量处理标本。而滴染式系统能够保证切片的均一性，避免交叉污染。传统浸染系统虽然在染色一致性上不如改良浸染法和滴染法，但是其使用成本较低。3种系统各有利弊，需根据各自科室的实际情况，选择适合的染色系统。

　　参考文献：

　　[1]王德田，董建强，梁智勇。实用现代病理学技术[M].北京：北京协和医科大学出版社，2012：61-62.

　　[2]薛晓伟，王德田，李星奇。Infinity HE高清恒染系统在病理常规染色中的应用[J].临床与实验病理学杂志，2014，30（9）：1072-1073. DOI:10.13315/j.cnki.cjcep.2014.09.038.

　　[3]KorzhevskiǐDE.Preparation of Harris hematoxylin without use of mercury oxide[J].Morfologiia, 2003, 124（4）：93-94.

　　[4]OhiraT, IshikawaK. Preservation of calcium pyrophosphate dihydrate crystals: effect of Mayer's haematoxylin staining period[J]. Ann Rheum Dis, 2001, 60（1）：80-82.

　　[5]CahillA, PearsonJ. Measurement of stainer bath contamination and evaluation of common mitigation strategies[J]. J Histotechnol, 2012, 35（3）：130-139. DOI:10.1179/2046023612Y.0000000013.

　　[6]骆新兰，姚军，黄泳军，等。染色方式与制片污染相关性的探讨[J].中华病理学杂志，2014，43（12）：834-836. DOI:10.3760/cma.j.issn.0529-5807.2014.12.010.

　　[7]刘勇，卢少芳，周虹，等。染色后干片是影响苏木精-伊红染色质量的重要因素[J].中华病理学杂志，2013，42（4）：271-272. DOI:10.3760/cma.j.issn.0529-5807.2013.04.014.

　　[8]张威，骆新兰，朱小兰，等。Lillie-Mayer苏木精在冷冻切片快速进行性染色中应用[J].临床与实验病理学杂志，2008，24（1）：114-115. DOI:10.3969/j.issn.1001-7399.2008.01.029.

　　[9]袁燕玲，李鑫，谢阿欢，等。早期食管癌及癌前病变内镜下切除标本的取材及制片技术[J].中华病理学杂志，2013，42（5）：340-341. DOI:10.3760/cma.j.issn.0529-5807.2013.05.012.