应用黑曲霉表达重组酶制剂的研究

【摘要】：选育优良的菌种是酶制剂产业的核心问题。用传统的菌种生产酶制剂往往存在着产量低、工艺复杂、成本高等缺点。采用工程菌高效表达酶蛋白,是降低酶制剂生产成本、创制新型酶制剂的有效途径,也是该领域的竞争焦点。发展安全、通用、高效、规模化表达系统,是全面提高酶制剂产业技术水平的战略必争之地,对于酶制剂产业实现变革性突破具有十分重要的意义。黑曲霉具有卓越的表达和分泌酶蛋白的能力、安全性高、产酶制剂种类丰富、工业发酵技术和设备成熟、遗传背景清晰,是理想的酶制剂表达系统。近年来,研究和开发黑曲霉等丝状真菌表达系统成为工业生物技术研究领域的热点。本文简要介绍我们在黑曲霉表达系统方面的一些研究结果,希望能增进交流与合作。一、受体菌的选择选择受体菌时应综合考虑菌株的生产性能(如分泌蛋白种类和能力、胞外蛋白酶活性、是否适合于高密度深层液体发酵等)和遗传操作的难易程度等因素。以糖化酶生产菌为基础,建立了筛选技术。通过转录组和分泌蛋白质组研究,揭示了其高水平转录的基因和高效分泌的蛋白,明确了遗传操作的技术路线。二、遗传操作技术关于丝状真菌的遗传操作技术已有诸多研究报道,按转化方法分类有农杆菌介导法、原生质体-PEG法、电击转化法、基因枪转化法、限制性内切酶介导转化法等;按整合位点分类有定点整合技术和随机整合技术;按遗传操作目的分类有超量表达技术、基因敲除技术和RNA干扰技术等。我们建立了农杆菌介导的同源重组技术,实现了对glaA、asaA、amyA、amyB、amyR、creA、prtT等多个位点的基因置换或敲除,基因操作的效率和精确性都很高。在此基础上,结合基于pyrG的双向筛选技术实现了对黑曲霉的多次转化。可应用于以下方面:(1)消除背景蛋白;(2)目的基因的多位点多拷贝整合;(3)多基因共表达;(4)基因组改良。为持续提升工程菌的生产性能提供了技术保障。三、酶基因的表达研究1.强启动子与启动子工程使用强启动子是实现酶制剂基因高效表达的最重要的,也是最为经济有效的方式。通过查阅文献和研究受体菌工业发酵条件下的转录组,我们筛选了一些高表达基因的启动子。对这些启动子进行功能分析后,确定了糖化酶基因启动子PglaA和三磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子PgpdA可用于调控目的基因在受体菌种的高效表达。进一步对PglaA和PgpdA进行能够了改造,改造后的启动子PglaA-6R和PgpdA-3B可显著提高木聚糖酶的表达水平。2.酶基因在黑曲霉中的表达通过对不同酶基因在黑曲霉中的超量表达研究,证实适合在黑曲霉中表达的酶制剂基因有:黑曲霉来源的α-淀粉酶基因amyA、甘露聚糖酶基因man5A、木聚糖酶基因xynB、阿魏酸酯酶基因faeA、内切葡聚糖酶基因eng1、eglA;脯氨酰内肽酶基因protA、天门冬酰胺酶基因asp、多聚半乳糖醛酸酶基因pgaB、α-半乳糖苷酶基因aglB、单宁酶基因tan;白曲霉来源的酸性蛋白酶基因pepB、绒毛栓菌来源的漆酶基因lac2等。总之,在该表达系统中,黑曲霉及其近缘物种中分泌表达的酶蛋白更可能实现高效表达,达到产业化前沿甚至领先水平。