Nature | CRISPR-Cas9基因编辑系统R-loop形成和活化的结构基础

CRISPR-Cas9基因编辑系统是基因治疗研究的代表性技术，如何规避脱靶效应引发的安全风险是当前研究的热点。研究人员曾尝试多种策略以降低CRISPR-Cas9系统的脱靶效应（详见BioArt报道：Nat Biotech丨提高CRISPR特异性的新方法，Nature Methods | 黄兆麟团队筛选出可降低脱靶效应的SpCas9变体）【1，2】。此外，研究人员还对CRISPR-Cas9系统脱靶的结构基础进行深入研究，并开发出兼具低脱靶效应和高切割速率双重优势的Cas9突变体（详见BioArt报道：Nature | CRISPR-Cas9基因编辑系统脱靶的结构基础）【3】。不过，目前研究者对CRISPR-Cas9系统的R-loop形成及后续的活化机制还缺乏全面了解。

2022年8月24日，来自瑞士苏黎世大学的Martin Jinek实验室在Nature发表题为R-loop formation and conformationalactivation mechanisms of Cas9的论文。文章利用冷冻电镜对CRISPR-Cas9系统R-loop形成的机制进行了全面系统的分析，并揭示了Cas9核酸酶活化的结构基础，这为降低脱靶改善CRISPR-Cas9系统的安全性提供了新的见解。

研究者指出，PAM近端sgRNA-DNA互补序列长度为6bp便可保障CRISPR-Cas9系统形成稳定的R-loop结构。随后通过分析PAM近端sgRNA-DNA互补序列长度为6、8、10、12、14bp时所形成的SpCas9-sgRNA-DNA复合物结构，研究者发现R-loop形成过程中构象变化最显著的结构域为REC2、REC3和HNH三大结构域。

PAM近端sgRNA-DNA互补序列长度为6bp时，sgRNA首先与互补的靶标DNA单链（简称为TS DNA）形成5bp的sgRNA-DNA杂合双链，更长杂合双链（>5 bp）的形成则被Cas9的Y450氨基酸阻碍。研究还发现，杂合双链与REC2结构域构象变化密切相关。PAM远端的DNA双链会被REC2/3结构域形成的正电缝隙锚定，其中REC2的多个位点（S219、T249和K263）可结合NTS DNA而REC3的多个位点（R586和T657）则结合TS DNA。此外，R-loop形成的初始阶段，NTS发生重定位并与RNA-TS DNA杂合链平行，而sgRNA的5’末端则位于HNH与PI结构域形成的正电缝隙中。

PAM近端sgRNA-DNA互补序列长度为8bp时，Y450便难以阻挡>5bp的sgRNA-DNA杂合双链形成。此时REC2和REC3结构域的构象进一步改变，Cas9蛋白REC2及REC3的其它位点也会结合PAM远端的DNA双链。

考虑到Y450在R-loop形成中的关键作用，研究者对Y450A突变后Cas9的脱靶风险进行分析。结果显示Y450A能显著降低Cas9对脱靶位点的切割速率从而提高其特异性。研究还指出，与包含PAM远端碱基错配的脱靶位点相比，包含sgRNA核心区（PAM近端10bp称为核心区）碱基错配的脱靶位点更难以形成稳定的R-loop结构，且受Y450A突变影响更大，脱靶风险更低。

当sgRNA-DNA互补序列长度为10bp时，PAM远端的DNA双链会发生重定位，被REC3、RuvC和HNH结构域形成的正电中央结合通道锚定。此时，PAM远端的DNA双链会与sgRNA-TS DNA杂合链形成连续的碱基堆积，被sgRNA置换出的NTS DNA单链则位于HNH结构域下方并与RNA-TS DNA杂合链平行。更深入分析发现，PAM远端的DNA双链是楔入REC3、RuvC和HNH的 L1连接区中间，这也导致REC2结构域发生位移并掩蔽TS DNA的切割位点。REC2位移也导致REC2的负电螺旋区（简称DDD螺旋）与REC3的正电螺旋区（简称RRR螺旋）形成新的静电互作。研究还指出，REC2的DDD螺旋核心氨基酸的丙氨酸突变能有效降低脱靶位点的体外切割效率，而REC3的RRR螺旋核心氨基酸的丙氨酸突变只能降低包含sgRNA核心区错配的脱靶位点的切割效率。由此可知，REC2-REC3互作对R-loop形成过程中Cas9的结构重塑很重要。

在sgRNA-DNA互补序列长度为6bp、8bp或10bp时，HNH核酸酶结构域被RuvC和PI结构域包裹，且活性区被掩蔽。R-loop区杂合链达到12bp时，REC2/3以及PAM远端的DNA双链构象保持稳定，但HNH结构域开始丢失稳定性。当R-loop区杂合链达到14bp乃至16bp时，HNH结构域发生明显位移并靠近sgRNA-TS DNA形成的杂合链区域。PAM远端的R-loop形成时，RuvC结构域的环状结构会重塑并与L2连接区互作，进而促进L2的位移和HNH的重定位，并导致中央结合区的关闭。不过此时HNH结构域仍处于失活状态。

已知PAM远端4bp错配会抑制Cas9的酶切活性，而仅第19、20碱基有错配的位点则能被Cas9有效切割。当R-loop区杂合链达到18bp时（1mM Mg2+），HNH结构域仍处于与16bp R-loop相似的失活态，而REC2和REC3结构域则处于与12、14、16bp R-loop相似的构象，这与早前的报道一致。之后研究者对活化状态的Cas9-sgRNA-DNA复合物进行分析，发现其在TS和NTS的切割位点与已有报道一致。但与已有报道不同的是，新结果发现，NTS DNA单链切割后，PAM近端的NTS仍被RuvC活性位点结合，此时REC2发生位移并远离TS切割位点，HNH结构域则发生约140°旋转以切割TS DNA单链。以上的构象改变能被PAM远端的sgRNA-TS DNA杂合链弯曲及REC3重定位所促进。研究还指出，L1和L2连接区的重构导致了HNH旋转，最终导致NTS结合缝隙拓宽和RuvC活性区的暴露。综上可知，R-loop的形成与HNH结构域重定位以及RuvC活性区的暴露是偶联的，这也与已有的单分子研究吻合。

总体而言，系统性的结构分析指出，CRISPR-Cas9活化过程中，R-loop的形成与核酸酶活化所必须的结构域重构之间存在多重偶联的关系。R-loop形成的初始阶段，REC2/3结构域可锚定靶位点DNA双链的末端，R-loop的中后期会促进REC2/3的重构及HNH核酸酶结构域的重定位，形成一种失活检查点的构象。R-loop达到完成态后会诱导HNH的活化，sgRNA-TS DNA杂合链的扭曲以及REC2/3重构。本研究厘清了Cas9活化的结构基础，也为CRISPR-Cas9基因编辑系统的深度优化提供了新的方向和思路。

原文链接

https://doi.org/10.1038/s41586-022-05114-0

参考文献

1. Kocak, D.D., Josephs, E.A., Bhandarkar, V. et al. Increasing the specificity of CRISPR systems with engineered RNA secondary structures. Nat Biotechnol 37, 657–666 (2019).

2. Choi, G.C.G., Zhou, P., Yuen, C.T.L. et al. Combinatorial mutagenesis en masse optimizes the genome editing activities of SpCas9. Nat Methods 16, 722–730 (2019).

3. Bravo, J. P. K. et al. Structural basis for mismatch surveillance by CRISPR–Cas9. Nature 603, 343–347 (2022).