彭宇, 钱慧, 张新, 谢渭芬. 三结构域蛋白超家族在慢性肝病及肝癌中的研究进展[J]. 中华肝脏病杂志, 2022, 30(12): 1387-1391.
DOI: 10.3760/cma.j.cn501113-20220702-00363.
通信作者：谢渭芬， Email：weifenxie@medmail.com.cn
正文
慢性肝病（chronic liver disease， CLD）包括脂肪性肝炎、病毒性肝炎、肝硬化和肝癌等一系列肝脏疾病，对全球经济和人类健康的负担不断增加。作为 CLD 的终末发展阶段，肝硬化和肝癌的发病率和病死率很高，每年大约有200万人死于肝硬化和肝癌［1］。三结构域（tripartite motif，TRIM）蛋白家族是E3连接酶家族中最大的家族之一，其中大部分成员具有E3泛素连接酶活性，在炎症、免疫、凋亡、自噬和癌变等细胞过程中具有重要功能［2］。近年来研究者发现，TRIM蛋白与CLD及肝癌的发生发展密切相关。现重点介绍TRIM蛋白家族介导的底物泛素化功能、TRIM蛋白家族对CLD发展的调控机制，并对TRIM蛋白作为CLD和肝癌药物治疗靶点和临床应用前景进行展望。
TRIM蛋白家族的结构与功能
TRIM蛋白的共同特征是其氨基末端（N端）含有一个TRIM，由 1 个环指结构域（RING-finger domain）、1 个或2 个锌指结合域（B-box）和 1 个螺旋 －螺旋结构域（coiled-coil region）组成。RING-finger 结构域结合 E2 泛素结合酶，赋予TRIM蛋白发挥E3泛素连接酶的作用。在TRIM 蛋白羧基末端（C 端）存在几种不同的结构域，包括PRY、SPRY、COS、FNIII和 PHD等结构域，有助于底物的差异识别和酶活调节，是TRIM亚家族分类的基础。然而有8 种 TRIM 蛋白不具有 RING 结构域 ，如 TRIM14、TRIM20和TRIM16等，有报道称TRIM16可通过B-box结构域发挥E3连接酶功能［3］。泛素分子中有7个赖氨酸残基（K6、K11、K27、K29、K33、K48和 K63）和一个 N 端蛋氨酸（M1）位点，泛素之间可通过这些残基相互连接形成多泛素链，泛素链的C端与靶蛋白的赖氨酸残基之间形成肽键，即泛素偶联。TRIM蛋白介导的靶蛋白泛素化通常发生两种结局，一种是通过K48或K11泛素化介导的26 S蛋白酶体降解；另一种是非蛋白水解途径，如K63泛素化引起的蛋白激酶活化、K27泛素化介导的蛋白稳定性调控等［4］。
TRIM蛋白与脂肪性肝炎
代谢相关脂肪性肝病（metabolic associated fatty liver disease， MAFLD）是一种与肥胖、胰岛素抵抗和代谢功能障碍等密切相关的异质性肝病，在持续的代谢应激下可发展为非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis， NASH）［1］。肝细胞脂肪变性是MAFLD的一个关键特征，肝内脂肪沉积及纤维化可促使MAFLD进展为肝硬化甚至肝癌。已发现TRIM蛋白参与的肝脏脂质代谢、炎症和损伤等病理过程在MAFLD发生发展过程中起到重要作用。
转化生长因子激酶 1（TGF-β -activated kinase 1，TAK1）是 TGF- β 信号通路的激活剂 ，磷酸化的 TAK1 （p-TAK1）激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和核因子（NF）-κB等信号通路，促进NASH以及相关代谢紊乱。近年来TRIM蛋白与TAK1的相互作用及活性调控是NASH领域的一个研究热点。NAFLD与NASH患者肝脏中可检测到 TRIM8 显著上调，TRIM8 直接与 TAK1 结合，促进TAK1发生K63泛素化从而活性增强［5］。TAK1的K63泛素链可被去泛素化酶 CYLD去除，导致 TAK1-JNK-p38级联信号被阻断，TRIM47 则通过泛素化降解 CYLD 以恢复 TAK1 活性［2］ 。另外 ，TRIM26 促进 TAK1 结合蛋白1 （TAB1）的 K11泛素化，进一步调控 TAK1磷酸化以及下游NF-κB和MAPK信号通路的激活［6］。相反，TRIM16介导了p-TAK1的K48泛素化降解，从而减弱MAPK信号通路的激活，减轻小鼠肝脏脂质累积、炎症和纤维化［7］ 。针对TAK1的去泛素化或p-TAK1的泛素化降解为NASH干预治疗提供了靶点。
部分TRIM蛋白的缺失可导致NASH相关代谢紊乱（胰岛素抵抗、糖代谢异常等）。转录共调控因子TRIM24与染色质相互作用直接调控脂质代谢基因的表达，TRIM24敲除鼠自发产生肝脂肪变性、肝损伤、肝纤维化和肝癌，提示TRIM24的功能对于维持肝脏稳态必不可少［8］。肝细胞特异性敲除TRIM31则加重了高脂饮食诱导的胰岛素抵抗和肝脂肪变性，TRIM31不止靶向一种底物来调控NASH，它既促进菱形蛋白酶家族成员Rhbdf2的K48泛素化，也介导转化生长因子活化激酶1 （MAP3K7）的K48泛素化降解，从而抑制下游 Jnk1/2-NF- κB p65 级联信号的激活［9］ 。由TRIM37 基因突变引起的肌肝脑眼侏儒症（Mulibrey nanism， MUL）患者青春期即出现胰岛素抵抗、脂肪肝、Ⅱ型糖尿病甚至肝纤维化，TRIM37与过氧化物酶体及泛素-蛋白酶体途径的联系是MUL发生的重要机制［10］。脂肪酸合成酶（FASN）增加了机体的甘油三酯水平，TRIM28 促进FASN的K48泛素化降解从而抑制肝细胞脂质沉积，揭示了在翻译后水平调控FASN稳定性的一种新的机制［11］。目前脂肪肝治疗研究主要围绕减轻或逆转脂肪变性及炎症来展开，TRIM家族在脂质代谢方面发挥的调控作用为丰富治疗手段提供了思路。
TRIM蛋白与病毒性肝炎
大量 TRIM 家族成员作为干扰素刺激基因（Interferon-stimulated genes， ISGs），在肝炎病毒感染及I 型干扰素治疗中发挥着至关重要的作用［12］。为了解IFN-α抗HBV感染的具体分子机制，Tan等［13］筛选了145个 ISGs与HBV X蛋白（HBx）与之间的相互作用，发现TRIM5γ不仅通过B-Box结构域介导HBx蛋白的K48泛素化降解，它还招募 TRIM31 进一步促进 HBx 的泛素化降解从而抑制HBV复制，提示IFN-α诱导高表达TRIM5γ的患者可能具有更好的抗病毒治疗效果。此外，HBx 的 C 端能够与TRIM14 的 SPRY 结构域相互作用 ，I 型 IFN 诱导的TRIM14与HBx结合在空间上阻断了HBx介导的DNA复制［14］。HBV DNA聚合酶在HBV复制中同时具有聚合酶和逆转录酶活性，TRIM21一方面通过促进HBx的K48泛素化与降解，另一方面促进HBV DNA聚合酶的泛素化降解从而抑制HBV转录和复制［15］。鉴于HBx和HBV DNA聚合酶在HBV感染和复制中的核心机制，TRIM蛋白对HBx的调控或有助于控制HBV感染。
IFN-α 在抗病毒先天免疫中发挥重要作用，内源性IFN-α由病毒通过Toll样受体、视黄酸诱导基因I （RIG-I）等模式识别受体诱导。IFN-α的产生进一步刺激TRIM25表达，使RIG-I发生K63泛素化并活化，传递并放大抗病毒信号［12］。作为线粒体抗病毒免疫的组成部分，TRIM14增强I型IFN的产生并活化NF-κB通路，抑制水疱性口炎病毒和仙台病毒的复制，也有研究者指出TRIM14的抗HCV活性不依赖于 IFN 或 NF-κB 通路的激活，而是与非结构蛋白NS5A的K48泛素化有关，NS5A参与了HCV病毒RNA的复制过程［3］ 。IFN-α 诱导的 TRIM14 和 TRIM22 通过其SPRY结构域与NS5A相互作用，促进NS5A蛋白泛素化降解，抑制HCV在肝细胞中的感染和复制［2］。另外，TRIM22和TRIM5 参与机体先天免疫应答并具有抗病毒活性 ，TRIM22表达水平与IFN-α联合利巴韦林治疗HCV患者的疗效成正相关［3］ 。针对IFN系统和TRIM蛋白之间的相互作用，开发相关治疗方法，或可解决部分病毒性肝炎患者IFN治疗的耐药问题。
TRIM蛋白与肝纤维化
由慢性肝损伤产生的大量炎症介质使肝星状细胞（hepatic stellate cells， HSC）激活并转化为肌成纤维细胞，不断分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原等细胞外基质，导致肝纤维化。TRIM33又称转录中介因子1γ （TIF1γ），它与α-平滑肌肌动蛋白（alpha-smooth muscle actin， α-SMA）启动子区结合并抑制α-SMA的转录，阻碍HSC激活［16］。上调TRIM26可促使活化的HSC发生铁死亡，减轻四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化，其原因是 TRIM26 促进清除活性氧的关键蛋白SLC7A11泛素化降解，导致脂质过氧化［17］ 。从活化的肝星状细胞系（LX2）中筛选出的差异基因提示TRIM15的上调激活了LX-2细胞，增强了α-SMA表达和Ⅰ型胶原分泌，并促进 LX-2 的增殖和迁移［18］ 。这些研究提示 TRIM 蛋白对HSCs的增殖与活化以及细胞外基质的分泌发挥调节功能。
TGF-β通路的异常激活对多种器官的纤维化均起到重要作用。Lee等［16］发现TRIM33通过抑制TGF-β1及其下游基因Smad2/3和Smad4的激活而减轻肝纤维化、肺纤维化和心肌纤维化。NASH是肝纤维化的重要诱因，前文已提到TRIM8和TRIM47通过促进TAK1磷酸化激活TGF-β及下游级联信号通路，促进肝纤维化，而 TRIM16 则通过介导p-TAK1降解减轻肝纤维化［7］。病毒感染是肝纤维化的常见病因，TRIM37在HBV阳性的肝纤维化患者中上调并降解SMAD7从而激活TGF-β信号，促进了HBV感染的小鼠肝脏中Ⅰ/Ⅲ型胶原的表达［19］。TRIM52对镁离子依赖的蛋白磷酸酶 1A（PPM1A）的降解活化了 TGF-β 信号转导，促进LX2细胞增殖和纤维生成［2］。可见靶向TGF-β信号通路对于抑制纤维化途径中细胞外基质的产生具有重要作用，是预防和治疗肝纤维化的关键靶点之一。
TRIM蛋白与肝细胞癌
大量研究表明，TRIM蛋白与肝细胞癌（hepatocellular carcinoma， HCC）密切相关。但不同 TRIM 蛋白在 HCC 中的作用差别很大，既有促癌作用，也有抑癌作用，有的TRIM蛋白在肝癌不同阶段发挥相反的作用。
1． TRIM 蛋白的促癌作用 ：肿瘤组织中高表达TRIM21、TRIM25、TRIM59 等 TRIM 蛋白的 HCC 患者总生存期与无病生存期较短［20-21］ ，TCGA 数据库分析提示TRIM11、TRIM28、TRIM37、TRIM44、TRIM52、TRIM65 等mRNA水平在HCC组织中显著升高且与患者的不良预后相关［22］。TRIM31 mRNA高表达与较大的肿瘤体积、较晚的肿瘤淋巴结转移（TNM）分期关联，TRIM4 DNA低甲基化与NASH相关的HCC密切联系，表明这些TRIM家族成员可能作为促癌因子参与HCC的发生发展［22-23］。
Akt、mTORC1、NF-κB、Wnt/β-catenin等多种信号通路已被广泛证明与HCC发生发展及耐药相关。TRIM蛋白可通过介导相关信号通路抑制因子的降解，参与一系列信号通路的激活，促进HCC的增殖、迁移、侵袭等恶性生物学行为（ 表 1）。此外 ，TRIM37 和 TRIM44 分别激活 Akt 和NF-κB信号通路诱导HCC细胞对索拉非尼以及阿霉素耐药［24］；TRIM28则通过活化蛋白酶体功能，促进HCC细胞对蛋白酶体抑制剂硼替佐米的耐受［22］。说明TRIM蛋白参与的信号通路调控介导了HCC化学治疗耐药。
抗氧化通路Keap1-Nrf2在癌症中发挥着一个矛盾的作用，Nrf2入核后提高了抗氧化基因的表达进而促进肿瘤细胞的存活，也通过维持内环境氧化还原稳态发挥肿瘤抑制因子的作用。Wang［21］等研究表明TRIM21介导p62的K63泛素化，抑制 p62-Keap1-Nrf2抗氧化通路，DNA 氧化损伤增加致癌突变促进 HCC 发生。Liu 等［20］ 发现 TRIM25 促进Nrf2入核发挥功能以减少活性氧的产生，有利于HCC细胞在内质网应激状态下的生存。因此，在肿瘤的不同进展阶段通过靶向 TRIM21或 TRIM25以调控 Nrf2水平，或可产生良好的抑癌效果。
针对TRIM蛋白的E3泛素连接酶活性是潜在的抗癌药物研发的方向。已有报道TRIM24调控p53的泛素化降解促进HCC进展，针对TRIM24的蛋白结合位点PHD/溴域，目前已经开发出一些小分子抑制剂用于抑制 TRIM24 活性［22］。也有研究利用多肽阻断TRIM蛋白与底物的相互作用，逆转泛素化介导的抑癌蛋白降解从而抑制癌细胞的增殖。运用小分子抑制剂或多肽等靶向药物技术破坏TRIM蛋白与底物的相互作用可能是一种有前景的 HCC 治疗策略。
2．TRIM蛋白的抑癌作用：TRIM家族中还有部分蛋白通过调控免疫信号、膜运输、DNA修复和染色质重组等生物学功能，抑制HCC的发生发展［3］。TRIM58在HCC组织中的表达降低与肝切除术后无病生存期较差有关；TRIM7靶向Src激酶的K48泛素化降解，抑制下游的mTORC1-S6K1促癌信号；TRIM33促进 Smad4单泛素化阻止 Smad2/3/4复合物形成，抑制TGF-β信号诱导的细胞侵袭和转移［2，22］ 。TRIM24与TRIM28蛋白在HCC的不同阶段可能发挥相反的作用，作为转录共调控因子，它们对于维持肝脏稳态抑制HCC 发生至关重要，而在 HCC 进展期则发挥促癌因子的功能［8，27］。
上皮间质转化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）是癌细胞转移与扩散的一个特征 ，TRIM16、TRIM26以及TRIM50通过靶向一系列EMT调控因子的泛素化降解，抑制 HCC 细胞的 EMT 过程［28］ 。TRIM16 抑制EMT调控因子ZEB2的表达及靶基因E-cadherin的转录，抑制体内HCC的转移［22］；TRIM26靶向泛素化降解EMT调节因子ZEB1，抑制HCC细胞的增殖和迁移；TRIM50促进转录因子 SNAIL 的 K48 泛素化降解，逆转了 SNAIL 介导的 EMT［22， 28］ 。这些工作提示了通过招募这类抑癌 TRIM 蛋白去特异性识别并降解癌蛋白以治疗 HCC 的潜在应用价值。
小结与展望
作为参与蛋白泛素化修饰的E3连接酶，TRIM家族已被证明在多种肝脏疾病的发生发展过程中起到了重要的作用（表2）。TRIM蛋白调控的TGF-β、MAPK和NF-κB等重要信号通路与脂肪性肝炎、肝纤维化及肝癌的发生密切相关，表明TRIM有希望作为慢性肝病及肝癌预防与治疗的潜在靶点。TRIM家族作为干扰素刺激基因增强了IFN抗病毒治疗的效果，为开发辅助药物以提高病毒性肝炎治疗的疗效提供了实验基础。基于大量TRIM家族成员在肝癌发生发展中的突出作用并且与肝癌的预后相关，或可将TRIM蛋白纳入肝癌的预后评估模型。此外，TRIM蛋白通过氧化/还原、免疫、炎症等相关信号参与了化学治疗耐药，提示可将TRIM家族作为解决化学治疗耐药问题的一个切入点。目前已经有一些靶向TRIM蛋白的小分子抑制剂已经逐渐被开发，但仍存在一定的局限性。首先，要将靶向抑制剂应用于肝病治疗，需完善其他器官的应答机制以减少全身不良反应；其次，如何检测机体中失调的TRIM蛋白还需进一步探讨。未来，随着对肝脏疾病发生发展机制的深入探索以及新型靶向药物技术的开发，这些问题将有希望得到解决。我们相信，靶向TRIM蛋白或联合相关靶点以及化学治疗药物的方案，将为慢性肝病或肝癌患者带来福音。
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