Nature 子刊 (IF:30.9): 恶臭假单胞菌通过IVB型分泌系统介导细菌杀伤、生物膜入侵和生物防治

Pseudomonas putida mediates bacterial killing, biofilm invasion and biocontrol with a type IVB secretion system

Gabriela Purtschert-Montenegro, Gerardo Cárcamo-Oyarce, Marta Pinto-Carbó, Kirsty Agnoli, Aurélien Bailly, Leo Eberl

Nature Microbiology：2022/09/19

Many bacteria utilize contact-dependent killing machineries to eliminate rivals in their environmental niches. Here we show that the plant root colonizer Pseudomonas putida strain IsoF is able to kill a wide range of soil and plant-associated Gram-negative bacteria with the aid of a type IVB secretion system (T4BSS) that delivers a toxic effector into bacterial competitors in a contact-dependent manner. This extends the range of targets of T4BSSs-so far thought to transfer effectors only into eukaryotic cells-to prokaryotes. Bioinformatic and genetic analyses showed that this killing machine is entirely encoded by the kib gene cluster located within a rare genomic island, which was recently acquired by horizontal gene transfer. P. putida IsoF utilizes this secretion system not only as a defensive weapon to kill bacterial competitors but also as an offensive weapon to invade existing biofilms, allowing the strain to persist in its natural environment. Furthermore, we show that strain IsoF can protect tomato plants against the phytopathogen Ralstonia solanacearum in a T4BSS-dependent manner, suggesting that IsoF can be exploited for pest control and sustainable agriculture.

许多细菌利用依赖接触的杀灭机制来消灭环境中的竞争对手。在这里，我们表明，植物根定植菌恶臭假单胞菌菌株IsoF能够在IVB型分泌系统（T4BSS）的帮助下杀死多种土壤和植物相关的革兰氏阴性菌，该系统以接触依赖的方式将毒性效应物递送到细菌竞争对手中。这扩大了T4BSS的靶标范围，迄今为止，T4BSS被认为只能将效应物转移到真核细胞中的原核生物。生物信息学和遗传学分析表明，这种杀人机器完全由位于罕见基因组岛内的kib基因簇编码，该基因簇最近通过水平基因转移获得。P.putida IsoF利用这种分泌系统不仅作为杀死细菌竞争对手的防御武器，而且作为入侵现有生物膜的进攻武器，使菌株能够在其自然环境中持续存在。此外，我们发现菌株IsoF可以以T4BSS依赖的方式保护番茄植物免受植物病原体青枯菌的侵害，这表明IsoF可以用于害虫防治和可持续农业

许多细菌利用接触依赖性杀伤机制(CDK)来消除其环境生态位中的竞争对手。本研究发现植物根系定植Pseudomonas putida(恶臭假单胞菌)菌株IsoF能够在IVB型分泌系统(T4BSS)的帮助下杀死多种土壤和植物相关革兰氏阴性菌，该系统以接触依赖的方式将毒性效应物传递给细菌竞争对手。这扩大了T4BSS的靶标范围，迄今为止人们认为它只能将效应物从真核细胞转移到原核细胞。生物信息学和遗传学分析表明，这种杀伤机器完全由位于罕见基因组岛内的kib基因簇编码，该基因簇通过水平基因转移获得。P. putida IsoF不仅利用这种分泌系统作为杀死细菌竞争对手的防御武器，而且作为侵入现有生物膜的进攻武器，使该菌株能够在其自然环境中持续生存。此外，还发现菌株IsoF能够以T4BSS依赖的方式保护番茄植株免受植物病原菌Ralstonia solanacearum(青枯病菌)的侵染，这表明IsoF可以用于害虫防治和可持续农业。

编译：微科盟XY，编辑：微科盟居居、江舜尧。

实验设计

结果

1.IsoF可杀死多种革兰氏阴性细菌

当以1:1的比例在最小培养基平板上共同接种P. putida IsoF(用绿色荧光蛋白(Gfp)标记)和P. putida KT2442(用mCherry(红色荧光染料)标记)时，24小时后从微菌落中未观察到红色荧光，表明KT2441已被杀死(图1a)。我们测定了两个菌株的菌落形成单位(c.f.u.s)，发现在2天后，IsoF完全消除了KT2442(图1a)。当用0.2 μm孔径过滤器分离两个菌株时，未发现任何不利影响，表明杀灭依赖于细胞间的接触(补充图1)。为了进一步了解潜在的分子机制，我们在添加碘化丙锭(PI)的平板上进行了接触依赖性杀伤(CDK)实验，以观察死亡细胞。24小时后，在两个接种培养物重叠处观察到PI染色，而纯培养区没有死亡细胞(图1b)。利用延时共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)证明，KT2442细胞与IsoF::Gfp(图1c和补充视频1)直接接触后被杀死。我们注意到死亡细胞没有溶解或形态改变。为了确定IsoF拮抗的目标物种范围，我们对几种土壤和植物相关细菌以及一些植物病原菌进行了荧光标记，并测试了它们对IsoF的敏感性。所有试验菌株与IsoF共培养24小时后均被杀灭(图1d，e)，这表明IsoF具有高效、广泛的宿主范围、CDK机制。

图1. IsoF对多种革兰氏阴性菌表现出接触依赖性拮抗作用。a，左：IsoF::Gfp在ABC琼脂平板上共接种后杀死KT2442::mCherry。荧光指示活菌。右：0 h、24 h和48 h时混合培养物中每种细菌种群的c.f.u.s百分比。数据为3个生物学重复( n = 3)的平均 ± s.d.非配对t检验，****P < 0.0001。b，IsoF拮抗仅限于IsoF::Gfp和KT2442菌落直接接触的区域。培养基中添加PI，以观察死亡细胞。c，IsoF::Gfp以接触依赖的方式杀死KT2442细胞。通过PI染色监测细胞死亡。d，IsoF可杀死多种革兰氏阴性植物相关细菌，包括P. aureofaciens、P. entomophila、P. chlororaphis、P. fluorescens、P. syringae、P. carotovorum和R. solanacearum。所有的竞争者都被用mCherry标记。e，C.f.u.s是在24 h的共同接种后确定的。数据是平均值 ± s.d.，来自3个独立的生物学重复(n = 3)。显示了3个独立实验的代表性荧光图像。

2.IsoF利用一种罕见的T4BSS来杀死细菌

为了确定IsoF的接触依赖性杀伤机制，我们构建了该菌株的mini-Tn5转座子插入文库，并测试了约5000个突变体对P. aureofaciens::mCherry的杀伤能力，该菌株易于培养，在混合大菌落生长时对IsoF介导的杀伤高度敏感(图2a)。对8个在杀死P. aureofaciens::mCherry方面有缺陷的mini-Tn5插入突变体的分析发现，一个大基因簇(指定kib用于杀灭、入侵、生物防治)中的4个基因编码了T4BSS(图2a、b及补充图2a)的几个元件。虽然细胞内病原体的T4BSS因其向真核宿主传递效应子的能力而闻名，但迄今为止尚未报道它们参与细菌间杀伤。为了验证突变筛选的结果，我们构建了定义的T4BSS突变体：ΔdotHGF缺乏分泌通道的主要结构成分，不能杀死P. aureofaciens或KT2442。同样，将编码假定蛋白TrbN和DotD的PisoF_02323到PisoF_02325区域失活，阻止了IsoF杀死其他细菌(图2c、d和补充图2b)。

基于网络的工具ICEfinder将kib基因簇鉴定为基因组岛的一部分，并定义了其与基因PisoF_02313和intA_3的边界，这与kib基因座的鸟嘌呤-胞嘧啶(GC)含量(58.8%)低于IsoF基因组的平均GC含量(62.6%)相一致。该岛大小为66917 bp，编码61个基因，其中17个与所述T4BSS结构基因具有同源性，37个被定义为假定蛋白质，4个编码I型限制性修饰(RM)系统和3'-端整合酶(图2b、c和补充表4)。BLAST搜索显示，kib基因存在于11株假单胞菌菌株中，其中8株被归类为恶臭假单胞菌(P. putida)(补充表3)。有趣的是，所有直系同源kib基因簇都表现出保守的共线性，并且位于相同的染色体位置，这表明它们有共同的祖先(补充图3和4)。值得注意的是，直系同源簇在岛的3'-端显示缺失，包括RM系统和侧翼整合酶。总之，虽然在少数假单胞菌菌株中发现了kib岛，但它是高度保守的，并且似乎编码细菌杀伤机器的所有组件，这表明它是最近通过水平基因转移获得的。

图2. 依赖IsoF T4BSS的杀伤机器在GI上编码。a，将单一IsoF-Tn5插入突变体与带有mCherry标记的P. aureofaciens混合。红色荧光表示突变体丧失杀伤活性。虚线矩形表示插入突变体在杀伤方面有缺陷。b，编码细菌杀伤所需的T4BSS的IsoF GI的遗传组织。该簇的长度为69.9  kb，编码17个T4BSS结构蛋白和34个假定蛋白。此外，3'端编码一个I型RM系统和一个整合酶。在确定的突变体中缺失的区域用黑色下划线：ΔdotHGF、Δ23、ΔdotD、Δ23-trbN-dotD、Δ33和Δ32-33。c，军团菌T4BSS基因簇的结构。蓝色突出显示的蛋白质同源物由IsoF GI编码。在军团菌Icm/Dot系统中，效应分子在通过外膜-核心复合物转位前与与4型偶联蛋白(T4CP)相互作用的分子伴侣结合。d，左图：共培养24  h后，P. aureofaciens::mCherry与IsoF野生型和各种缺失突变体竞争的荧光图像。右图：两个竞争菌株的c.f.u.s。数据为3个独立生物学重复(n = 3)的平均值 ± s.d。非配对t检验，*P < 0.05。

3.kib基因簇编码一个效应物-免疫(E-I)对

接触依赖性杀伤系统将有毒效应分子传递给细菌竞争对手。为了避免自我杀伤，攻击细菌会产生一种同源免疫蛋白来中和毒素。免疫和毒素基因形成所谓的E-I对，并且通常是共转录的。为了研究kib区域内是否存在E-I对，我们删除了49.5 kb包含所有kib基因(PisoF_02313至PisoF_02360，补充图4)的基因组岛。由此产生的突变体ΔT4B不再杀死P. aureofaciens或KT2442，并与这两个菌株(图2d和补充图2b)形成混合大菌落。我们推测E-I对的缺失会使ΔT4B突变体对野生型菌株敏感，而它的存在会赋予其抗性。CDK检测显示突变株被杀死，而与ΔdotHGF突变株共存(图3a)，证明杀死和自我保护所需的基因存在于kib簇内。此外，IsoF不能杀死突变体ΔdotHGF和Δ23-trbN-dotD，表明赋予免疫的基因不在被删除的区域内(扩展数据图5)。

图3. 在kib基因簇内编码E-I对。a，左图：ΔT4B突变体对IsoF野生型和ΔdotHGF缺失突变体的接触依赖性杀伤。右图：共接种24 h后确定的竞争菌株的c.f.u.s。b，效应物在缺乏同源免疫蛋白的情况下会对细胞产生毒性。采用以下条件挑战IsoF Tn23突变体库：(i)在液体培养基中振荡生长以防止细胞接触，(ii)在琼脂表面单独生长或(iii)在竞争菌株P. aureofaciens存在下生长以促进竞争(混合)。c，Tn-Seq Explorer软件独特的插入密度方法用于识别在不同生长条件下为生长提供适应性益处的基因。图中显示了3种生长条件下2个基因的Tn23插入情况。d，左图：IsoF对缺失突变体Δ32-33(缺少E-I对)、Δ33(缺乏效应基因)及其互补衍生物的CDK。右图：共接种24 h后测定的竞争菌株的c.f.u.s。e，左：IsoF野生型对突变体ΔT4B/pBBR::32和Δ32-33/pBBR::32的CDK。右：共接种24  h后测定的竞争菌株的c.f.u.s。f、g，KT2442和P. aureofaciens分别对缺失突变体Δ32-33(缺少E-I对)、Δ33(缺乏效应基因)及其互补衍生物的CDK。顶部：显示了三个独立实验的代表性荧光图像。比例尺，5 mm。底部：在培养24 h后测定竞争菌株的c.f.u.s。数据为3个独立重复(n = 3)的平均值 ± s.d。非配对t检验，*P < 0.05；**P  < 0.01；***P  < 0.001；****P < 0.0001。

4.转座子测序法鉴定免疫基因

免疫基因是必不可少的，因为缺乏免疫蛋白的细胞要么被邻近细菌杀死，要么因自我中毒而死亡。因此，可以通过转座子测序(Tn-seq)来识别潜在的E-I对。我们在IsoF中生成了一个饱和转座子插入文库，并将该文库置于三种不同的生长模式下：(1)在液体培养基中振荡生长以防止细胞间接触；(2)在琼脂表面单独生长；或(3)在竞争对手P. aureofaciens存在的情况下生长以促进杀伤(图3b和补充表5)。我们的分析表明，在所有三种处理中，PisoF_02332几乎没有转座子插入(图3c和补充表6)。该基因似乎与PisoF_02333共转录，可能构成E-I对。在PisoF_02332和PisoF_02333的计算机分析中，预测这两种蛋白质的亚细胞位置为胞质。与这一预测一致，但与X. citri和S. maltophilia的X-T4ASS免疫蛋白定位于周质的发现相反，我们无法在PisoF_02332的N端识别信号肽序列，也无法在蛋白(补充图6a)的C端识别已知军团菌效应因子的易位信号(补充图6a)。有趣的是，我们发现PisoF_02332具有C端FxxxLxxxK基序，这是军团菌T4BSS35的已知识别序列，表明免疫蛋白可能与其同源效应物一起转移。使用(1) PisoF_02332-33基因、(2) kib簇的所有同源基因和(3)携带kib位点的菌株的八个管家基因构建的系统发育树的比较揭示了一致的树拓扑结构，表明这些菌株形成了一个起源于共同祖先的确定谱系(扩展数据图7)。

为了评估这个假定的E-I对在细菌杀伤中的作用，我们删除了IsoF中的两个基因(PisoF_02332和PisoF_02333)，生成Δ32-33。我们还能够单独删除假定的效应基因，从而产生突变Δ33。我们注意到，相对于亲本菌株或突变株Δ31，Δ32-33在ABC最小培养基上生长较慢(补充图1)。尽管存在生长差异，但为了建立公平的竞争环境，我们在补充了酪蛋白氨基酸的ABC培养基上进行了Δ32-33的CDK测定，并将c.f.u.s标准化为Δ32-33单培养24 h后恢复的细胞数量。重要的是，Δ33无法与P. aureofaciens或KT2442竞争，且补充部分挽救了杀伤表型，表明PisoF_02333编码一种毒性效应蛋白(图3f，g)。这进一步得到了双突变体Δ32-33对P. aureofaciens和KT2442缺乏杀伤作用的支持，尽管我们无法通过补充恢复杀伤，但我们使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS–PAGE)来研究补充菌株中的表达。。虽然我们观察到与免疫蛋白对应的条带，但我们无法检测到毒素，这表明与毒素相比，免疫蛋白产生过多(补充图6b)。因此，我们假设杀伤没有恢复，因为补充菌株中免疫蛋白的非生理性过表达有效地中和了效应物。在与IsoF野生型的竞争中，突变体Δ33及其补充衍生物存活下来，表明这两个菌株都对IsoF效应毒素免疫。相比之下，突变体Δ32-33被IsoF杀死，而补充菌株与IsoF共存，这意味着PisoF_02332对kib介导的杀伤具有免疫力(图3d)。为了进一步验证这一点，在质粒(pBBR::32)上用PisoF_02332补充突变体ΔT4B和Δ32-33，并将所得菌株用于对IsoF的杀伤试验。当菌株Δ32-33/pBBR::32与IsoF共存时，突变体ΔT4B/pBBR::32被杀死(图3e)。SDS–PAGE分析表明，PisoF_02332在ΔT4B突变背景下不表达，这解释了其对kib介导的杀伤的敏感性，并表明kib基因簇编码PisoF_02332表达所需的功能或影响其稳定性(补充图6b)。

5.kib系统使IsoF能够侵入已建立的生物膜

在本研究的CDK实验中，孵育24 h后，IsoF的生长被限制在初始接种区域，这可能是因为死亡细胞形成了一个屏障，阻止了进一步的杀灭(图1b)。然而，在延长CDK平板培养时间后，我们观察到IsoF在(图4c和补充图5)培养72 h后开始侵入目标菌株占据的空间并形成卫星菌落。我们假设被杀死的细胞最终裂解，不再构成抵抗入侵的屏障，这表明依赖接触的杀伤可能是消除混合微生物生物膜中竞争者的有效方法。为了评估kib介导的杀死在混合物种生物膜中的作用，我们决定使用IsoF和KT2442，它们都是良好的生物膜产生者。为此，我们首先在流式细胞系统中建立了KT2442::Gfp(绿色)生物膜，然后引入IsoF::mCherry(蓝色)(图4a)。在1 d内，附着在表面的IsoF细胞开始增殖并形成大量的微菌落。2 d后，IsoF侵入并取代KT2442生物膜，形成成熟的生物膜。在接种IsoF后24-48 h内，KT2442生物膜的体积减少了约40%，经过2 d的竞争后达到与KT2442相当的生物量(图4b)。在没有竞争的情况下，KT2442生物膜的生物量随着时间的推移而稳步增加(补充图8a，c)。当预先建立的KT2442生物膜受到kib突变体ΔdotHGF或Δ23-trbN-dotD的挑战时，这两个突变体都不能形成微菌落或侵入现有的生物膜(图4a、b)。重要的是，分离出的ΔdotHGF和Δ23-trbN-dotD突变体形成了类似于IsoF野生型菌株的生物膜(扩展数据图8b，d)。我们推测IsoF利用其T4BSS在接触时杀死KT2442细胞，为IsoF生物膜的扩展创造了空间。为了验证这一点，我们用等量的细胞接种了IsoF::Cfp (青色)和KT2442::Gfp (黄色)的流式细胞，并通过添加PI(红色)作为细胞死亡的指标来监测邻近IsoF微菌落的KT2442微菌落的命运。在两个菌株直接接触(图4d，f)的位置观察到了死亡细胞。我们确定KT2442的生物膜体积减少了约20%(图4g)。接下来，我们可视化了在最小培养基琼脂垫表面的混合单层生物膜中使用IsoF::Gfp杀死KT2442的效果(图4d)。18 h后，我们观察到死亡的KT2442细胞(品红)中有92%位于IsoF::Gfp(绿色)细胞旁边，证明kib介导的杀伤作用严格依赖于细胞间接触(图4e)。当用ΔdotHGF或Δ23-trbN-dotD突变株(绿色)刺激KT2442时，观察到极少的死亡细胞，类似于单培养生物膜对照组(图4d，e)。这些结果表明，kib系统不仅允许IsoF保护自己免受竞争对手的侵害，还可以杀死生活在已建立的生物膜群落中的细菌。

图4. IsoF野生型入侵并取代预先建立的KT2442生物膜。a，KT2442::Gfp(绿色)的2天生物膜被IsoF::mCherry (蓝色)入侵，但不被ΔdotHGF::mCherry(蓝色)或Δ23-trbN-dotD::mCherry(蓝色)入侵。比例尺，30 µm。b，KT2442::Gfp相对于IsoF::mCherry、ΔdotHGF::mCherry和Δ23-trbN-dotD::mCherry的相对生物膜生物量(体积)。数据是平均值 ± s.d.，3个生物学重复(n = 3)。c，KT2442的宏菌落逐渐被IsoF::Gfp扩张的微菌落定殖。用PI补充培养基以观察死细胞(品红色)。d，IsoF、ΔdotHGF和Δ23-trbN-dotD(绿色)在培养18-20 h后对KT2442的CDK。指出了Isof::Gfp和KT2442的单培养物。通过PI染色观察死亡细胞。e，从CDK实验中随机选择的至少9幅图像中量化接触和未接触绿色荧光细胞的死亡细胞数量。作为对照，在没有竞争者的情况下也接种了菌株，并测定了死亡细胞的数量。数据为3个独立重复(n = 3)的平均值 ± s.d。非配对t检验，****P < 0.0001。f，共培养40  h后KT2442::Gfp(黄色)和IsoF::Cfp(青色)的混合生物膜。白色箭头表示在22 h和40 h的相同位置，其中死细胞(红色)通过PI染色可视化。g，KT2442和IsoF在22 h和40  h时的相对生物膜体积。非配对t检验，**P < 0.01 (n = 3)。

6.kib位点对IsoF的生物防治活性是必需的

体外竞争试验表明，IsoF杀死了Ralstonia solanacearum(青枯病菌)，而ΔT4B突变体则没有(图5a)。为了评估kib杀灭系统是否有助于生物防治应用，我们测试了IsoF是否能够保护番茄植株免受青枯病菌的感染，青枯病菌是一种在多种作物中引起青枯病的主要病原体。考虑到青枯病菌是一种土壤传播病原体，通过自然开口(例如出现侧根或伤口)进入植物，我们用小切口损伤了已建立的番茄幼苗(图5b)。在感染后22天，接种青枯病菌的对照植株严重萎蔫，出现了萎黄的迹象，根系和地上部发育受阻。相比之下，接种青枯病菌和IsoF混合物的幼苗90%没有出现萎蔫迹象(图5d)。然而，当幼苗与青枯病菌和kib突变体ΔT4B混合接种时，在85%的植株中观察到萎蔫和发育不良，表明IsoF通过kib介导的杀伤作用阻止了青枯病菌向植物组织扩散。为了准确评估青枯病的发展情况，我们测定了处理组个体的叶绿素含量，并测量了地上部面积和根重，以此作为植物健康的代表(补充图9)。这些数据进行了主成分分析和层次聚类(图5e)。前两个成分占方差的93.7%，得分散点图清晰地将单独接种IsoF和ΔT4B的群体与未处理的植株聚在一起，证实了菌株对番茄植株没有危害。与青枯病菌和IsoF共接种的植株优先与健康植株聚集在一起，而与ΔT4B共接种的植株优先与青枯病菌感染的植株聚集在一起。这表明IsoF以一种依赖于kib的方式降低了受伤番茄组织中的病原菌负荷。为了证实IsoF确实杀死了青枯病菌，我们找到了附着在根部的细菌，并确定了c.f.u.s。这表明，与IsoF共接种后的青枯病菌细胞数量显著低于接种ΔT4B突变体后的青枯病菌细胞数量(图5c)。为了在更自然的条件下评估IsoF的生物防治潜力，我们使用了一个基于土壤的感染模型，详见方法(图6a)。首先，我们用未伤苗和伤苗分别在浸透不同c.f.u.量的非无菌土壤上测试了青枯病菌的活性。108 c.f.u. ml−1的剂量对受伤幼苗的影响最强，其中约66%的植株没有超过2叶期(图6b，c)。当用IsoF和青枯病菌混合物浸湿非无菌土壤时，84%的植株和对照植株一样发育，而在联合接种青枯病菌和kib突变体ΔT4B的植物中，只有53%的植株发育出第二对叶片(图6d–f)。从根际回收的C.f.u.计数显示，当与IsoF或ΔT4B突变体共接种时，青枯病菌的c.f.u.s没有减少，这表明青枯病菌的杀伤可能会局部阻止病原体进入点对植物组织的入侵(图6g)。总之，这些结果表明IsoF对青枯病菌的生物防治能力取决于kib位点。

图5. Iso FT4BSS保护番茄植株免受体外细菌性枯萎病的侵害。a，左：mCherry标记的IsoF和ΔT4B对青枯菌的CDK。右：共同接种24 h后测定的竞争菌株的c.f.u.s。数据来自4个生物学重复( n = 4)的平均值 ± s.d.非配对t检验，*P< 0.05。比例尺，5 mm。b，所用实验方法的示意图。幼苗在根冠交界处用针损伤两次，并将其浸入细菌悬浮液中。棒状圆点表示绿色和粉红色的细菌。接种的幼苗转移到½MS平板上进一步生长。c，从番茄根部回收的细菌细胞的c.f.u.s。总共评估了28株植物，3个独立重复的(n = 3)每个处理至少8株。数据均为平均值 ± s.d。非配对t检验，****P < 0.0001。d，接种后22 d的离体番茄植株的代表性图像。假彩色图片显示根据RGB值估计的叶绿素含量。e，估计的植物健康参数的主成分分析(底部)和层次聚类热图(顶部)。色标(深橙色到蓝色)表示测量参数(根重、叶绿素含量、叶面积)的Z-Score值。

图6. IsoF保护生长在非灭菌土壤中的番茄植株免受青枯菌的侵染。a，所用实验方法的示意图。在这种感染模型中，非无菌土壤同时浸泡IsoF或ΔT4B和青枯菌的混合物。棒状圆点表示绿色和粉红色的细菌。幼苗在根冠交界处用针头伤害两次，然后盆栽到湿润的土壤中。b、c，未受伤(b)和受伤(c) Micro-Tom幼苗的试验。用不同量的Gfp标记的青枯病菌细胞浇灌土壤，并跟踪植株生长20 d。条形图表示接种后20  d的叶面积。d，Micro-Tom植株3个生物学重复中的1个的代表性图片。接种后22  d拍摄照片。e，在不同处理的细菌培养物浇灌的非无菌土壤上生长的植株的叶面积。生长曲线代表其中一个生物学重复的番茄植株的发育情况。f，条形图显示了接种20  d后的植株叶面积(n = 3)。g，从番茄根际恢复的细菌细胞的c.f.u.s。共评估了41株植物，每个处理至少10株，数据为平均值 ± s.d.。对于每个处理，具有相同字母的均值没有显著差异。方差分析，Tukey检验，P < 0.05。

讨论

虽然各种病原体使用T4BSS将效应分子易位到其真核宿主细胞中，但我们在此表明，P. putida IsoF使用T4BSS以接触依赖性方式杀死多种土壤和植物相关革兰氏阴性菌，将T4BSS靶向的生物范围扩展到原核生物。本研究的数据表明，kib位点是最近获得的一个基因组岛的一部分，能编码杀伤机制的所有组成部分。kib簇可能为IsoF在环境中的生存提供竞争优势，因为IsoF被证明是番茄根系的优秀定殖者。IsoF可杀死多种环境菌株，最显著的是P. putida KT2442，该菌株被证明使用其K1-T6SS作为抗菌杀灭装置。IsoF没有K1-T6SS基因簇的同源物，因此预计对KT2442的杀伤敏感。然而，当两个野生型菌株相互竞争时，IsoF消除了KT2441，这表明T4BSS介导的杀伤可能发生在KT2443启动其T6SS装置之前(图1a和3g)。先前的研究表明，细菌在部署T6SS时有不同的策略。虽然一些Vibrio cholerae(霍乱弧菌)以非靶向方式使用其T6SS，并在细胞内的随机位置组装和启动其装置，但P. aeruginosa只有在检测到附近另一种细菌的攻击后才组装并启动其细胞器，这一策略被称为T6SS以牙还牙反应。目前，KT2442 K1-T6SS和IsoF kib系统的触发器均未知。然而，IsoF杀死KT2442可能表明kib是组成型表达且以随机方式激活，而KT2442的K1-T6SS仅在受到攻击时被激活。这让人想起了一个发现，即T6SS阴性的霍乱弧菌菌株不会被P. aeruginosa杀死，而当两种生物都含有功能性T6SS43时，霍乱弧菌与P. aeruginosa共培养可被有效杀死。这就解释了为什么所有的kib突变体都与KT2442共存。还需要开展更多的工作，以阐明灭伤系统的触发或效能的差异是否对IsoF kib系统的优异性能负责。值得注意的是，IsoF杀死了许多已知使用T6SSS进行细菌间杀伤的细菌(扩展数据图10)。

本研究证明了P. putida IsoF具有前所未有的能力，以依赖kib的方式入侵和取代已建立的生物膜。除了kib外，生物表面活性剂putisolvin的产生，使菌株能够在半固体表面上游动，可能有助于IsoF的入侵能力。当混合生物膜在流动细胞中生长时，被杀死的细胞被营养流的剪切力移除。释放的空间随后被IsoF占据，最终导致了预先建立的生物膜的替换。值得注意的是，putisolvin可以有效分散生长在聚氯乙烯和玻璃表面的生物膜。因此，阐明这种生物表面活性剂在清除死亡细胞或将IsoF细胞转移到已建立的生物膜中的释放空间中的作用将是未来研究的一个有趣方向。

本研究证明，IsoF不仅能拮抗几种与经济相关的植物病原菌，还能保护番茄植株免受青枯病菌侵害(图5和图6)。众所周知，根际中分泌细菌素、抗真菌剂或抗生素的微生物是抑制植物病原菌的有效策略。本研究在细菌生物防治功能列表中增加了通过接触依赖性杀伤的生物膜入侵。鉴于生物防治应用的一个主要限制是接种剂无法在环境中建立自身，利用kib进行攻击和防御的IsoF可以用于生态友好型农业策略。