NAT REV MICROBIOL (IF:78): 重新审视抗生素耐药性的分子机制

Molecular mechanisms of antibiotic resistance revisited

Elizabeth M. Darby, Eleftheria Trampari, Pauline Siasat, Maria Solsona Gaya, Ilyas Alav, Mark A. Webber, Jessica M. A. Blair

Nature Reviews Microbiology：2022/11/21

Antibiotic resistance is a global health emergency, with resistance detected to all antibiotics currently in clinical use and only a few novel drugs in the pipeline. Understanding the molecular mechanisms that bacteria use to resist the action of antimicrobials is critical to recognize global patterns of resistance and to improve the use of current drugs, as well as for the design of new drugs less susceptible to resistance development and novel strategies to combat resistance. In this Review, we explore recent advances in understanding how resistance genes contribute to the biology of the host, new structural details of relevant molecular events underpinning resistance, the identification of new resistance gene families and the interactions between different resistance mechanisms. Finally, we discuss how we can use this information to develop the next generation of antimicrobial therapies.

抗生素耐药性是一种全球卫生紧急情况，目前临床使用的所有抗生素都检测到耐药性，只有少数新药正在研制中。了解细菌用来抵抗抗菌药物作用的分子机制，对于识别全球耐药性模式和改进现有药物的使用，以及设计不易产生耐药性的新药和对抗耐药性的新策略至关重要。在这篇综述中，我们探讨了抗性基因如何对宿主生物学做出贡献的最新进展，支持抗性的相关分子事件的新结构细节，新抗性基因家族的鉴定以及不同抗性机制之间的相互作用。最后，我们讨论了如何利用这些信息来开发下一代抗菌疗法

抗生素耐药性是全球卫生紧急事件，目前临床使用的所有抗生素都发现了耐药性，只有少数新药正在研制中。了解细菌用来抵抗抗菌药物作用的分子机制，对于识别全球耐药模式和改进现有药物的使用以及设计不易产生耐药性的新药和对抗耐药性的新策略至关重要。本篇综述探讨了抗性基因如何影响宿主生物学、支持抗性的相关分子事件的新结构细节、新抗性基因家族的鉴定以及不同抗性机制之间的相互作用等方面的最新进展。最后，讨论了如何利用这些信息来开发下一代抗菌疗法。

综述目录

1 渗透性降低

2 抗生素的主动转运

3 靶点改变、修饰和保护

4 药物的失活和修饰

5 靶点旁路

6 耐药破坏者的承诺

7 结论和未来展望

主要内容

抗菌素耐药性(AMR)是一项重大的全球卫生挑战，在全球范围内造成大量发病和死亡。了解耐药性背后的分子机制有助于设计治疗传染病的新策略。细菌存在各种耐药机制，其中一些是“固有的”，即细胞可以利用它已经拥有的基因在抗生素暴露下存活，有些是“后天获得的”，由此获得新的遗传物质提供了介导生存的新能力(表1)。我们对抗生素的工作原理以及细菌抵抗抗生素抑制或杀伤作用的主要机制的理解取得了实质性进展(图1)，包括环境因素对于许多耐药机制在确定其作用方面的重要性。例如，抗性基因和靶点的表达可以在不同的生长条件下发生显著变化。新的技术进步揭示了许多耐药机制的结构细节，包括外排系统复杂的多组分结构，这可能为抑制剂的发展指明了可能的途径，并为新发现的ABC-F核糖体拯救蛋白提出了一种作用机制。人们还了解了更多关于协同工作以产生高水平抗性的多种分子机制的重要性和等级(例如，外排对支持所有其他抗性机制的基础作用)。

此外，与获得耐药性相关的成本和收益现在得到了更好的理解。特别是，质粒、宿主和AMR基因之间的相互作用对于决定基因、载体和菌株的扩展方面十分重要。已经发现了一个由全球优势物种克隆成功获得特异性抗性基因的例子，例如，由大肠杆菌ST131获得超广谱β-内酰胺酶CTX-M-15，或由肺炎克雷伯菌ST258获得碳青霉烯酶KPC，这两者都在全球范围内传播。

本篇综述探讨了耐药机制并概述了不同机制的临床相关性。具体而言，本文讨论了通过减少细胞内药物积累(渗透性降低和抗生素外排)、修饰或改变细菌抗生素靶点、修饰或破坏药物本身以及绕过整个代谢途径来理解抗生素耐药性的最新进展。最后，还讨论了基因组学如何彻底改变了AMR的研究，以及这些信息如何共同帮助开发下一代抗微生物疗法。

表1 主要抗生素类别、主要靶点和耐药机制。

图1 抗生素耐药的分子机制概述。抗生素的失活是由降解或修饰抗生素分子的酶介导的。酶促降解涉及抗生素官能团的水解，从而使其失效。抗生素修饰酶将各种化学基团转移到抗生素上，从而防止抗生素与其靶点结合。靶点改变包括改变抗生素靶点以减少抗生素的结合。这可能涉及编码抗生素分子蛋白质靶点的基因突变或结合位点的酶改变。在绕过靶点过程中，抗生素靶点的功能由一种不受抗生素抑制的新蛋白质完成，使原来的靶点变得多余，抗生素无效。内流减少是由膜结构的变化介导的，例如，孔隙蛋白的下调，孔隙蛋白是一种跨膜蛋白，可以将抗生素等各种化合物被动转运到细菌细胞中。跨膜外排泵促进主动外排，将抗生素从细菌细胞中输出以降低其细胞内浓度。靶点保护通常涉及靶点保护蛋白与抗生素靶点的物理结合，从而使其免受抗生素介导的抑制。

1 渗透性降低

许多抗菌剂要发挥其活性，需要穿过细菌细胞膜才能到达目标。这在革兰氏阴性菌中尤为重要，革兰氏阴性菌具有双膜结构，使细胞包膜相对不易渗透，对许多对抗革兰氏阳性病原体的抗生素具有内在抗性，并对开发能够穿透细胞膜的新型抗菌剂提出了重大挑战。此外，包膜结构的改变，例如孔隙蛋白丢失或细胞质膜磷脂和脂肪酸含量的变化，会影响药物穿透细胞的能力，并可能导致AMR的出现。革兰氏阳性菌缺乏外膜，这使得它们对许多抗生素具有天然的渗透性；然而，影响流动性的细胞质膜成分的变化已被证明对降低抗生素的渗透性很重要。分枝杆菌产生广泛的外脂质层和多糖胶囊涂层，从而阻止亲水分子进入细胞。

革兰氏阴性菌的外膜是一个复杂的细胞器，经过进化可提供保护并具有屏障功能，同时仍允许吸收营养物质。来自肠杆菌的最新证据表明，在细菌生长过程中，外膜的渗透性是如何动态变化的，这反过来又会影响药物可以穿透膜的量。外膜包含孔蛋白，它们是β-桶蛋白通道，根据其功能和结构分为以下几类：一般非特异性通道(例如，OmpF和OmpC)；底物特异性通道(例如，PhoE和LamB)和小β-桶通道(例如，OmpA和OmpX)。通常，孔蛋白允许<600 kDa的亲水性化合物流入细胞，包括许多抗生素。在大肠杆菌和相关生物中发现的OmpF和OmpC是三聚体β-桶结构，已知不同的抗生素种类能够通过该结构。OmpF的孔径比OmpC大(分别为6.5–7Å和5.5–6Å)，这使得底物比OmpC更容易通过OmpF。尽管早期认为孔隙蛋白对某些底物表现出选择性，但最近的研究表明，孔隙蛋白扩散以自发、被动的方式发生，没有观察到主动的相互作用。

最近，孔蛋白结构的改变也被确定为抗生素耐药性的重要贡献者，证明这些不是进化上的静态结构，我们对孔蛋白结构-功能关系的了解也有所提高。例如， 肺炎克雷伯菌对碳青霉烯的耐药性部分是由非选择性孔蛋白OmpK35和OmpK36的修饰介导的；选择性插入(Gly115-Asp116)到OmpK36的loop3会导致孔显著收缩，从而增加对碳青霉烯类药物的耐受性。最近发现从患者身上分离出的多重耐药大肠杆菌分离株在OmpC内携带多个突变，这些突变会改变孔内的电荷，进而影响头孢噻肟、庆大霉素或亚胺培南等抗生素的渗透性。

肠杆菌中的孔蛋白表达受到环境刺激的积极调控(图1)。也许研究得最好的例子仍然是大肠杆菌中的OmpC和OmpF，其表达受EnvZ–OmpR双组分系统的控制。EnvZ是一种质周传感器蛋白，可感知环境变化并控制其同源反应调节因子OmpR的磷酸化状态。细胞中高水平的磷酸化OmpR导致ompF减少和ompC转录增加。这两种孔蛋白的差异调节允许适当的孔蛋白表达：在营养丰富的高渗透压环境中，小孔隙占主导地位。只产生较小孔隙的突变体在抗生素暴露下存活得更好。已有研究表明，碳青霉烯类在OmpR中选择多个第一步突变，导致孔蛋白表达减少。小调控RNA(sRNA)也可以在转录后水平上控制外膜结构。sRNA micF由一个与ompC不同的序列编码，并且在转录时，它通过与核糖体结合位点和ompF mRNA的起始密码子直接碱基配对来抑制ompF的表达，从而阻止翻译。这种sRNA的表达是有条件的，受各种环境刺激，如高渗透压条件。最近，micC sRNA已鉴定并观察到通过直接结合到ompC mRNA的5’非翻译区来抑制OmpC翻译。这些sRNAs的转录在抗菌素胁迫下被共同调节，β-内酰胺积极诱导micC的转录。

非特异性孔蛋白，如OmpF和OmpC，是肠杆菌的特征。然而，其他重要的病原体，如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)，却配备了多个特定的孔蛋白，允许不大于200 Da的分子进入。这种缺少较大的通用孔蛋白会导致膜高度不透水，特别是对亲水分子而言。在铜绿假单胞菌的情况下，OprD孔蛋白的缺失被广泛报道为具有临床重要意义的高水平碳青霉烯耐药机制。这通常与其他机制一起出现，最近对铜绿假单胞菌所有孔蛋白失活的影响的分析表明，任何单一孔蛋白的损失都不能完全消除药物进入，这表明了孔蛋白损失与其他机制之间协同作用的重要性。

2 抗生素的主动转运

除了防止药物进入细胞，细菌还可以将药物主动排出。外排泵是一种跨膜蛋白，可以以能量依赖性方式将包括抗生素在内的多种有毒化合物转运穿过细菌膜。虽然所有细菌都含有多个外排泵，但它们是革兰氏阴性菌中特别重要的AMR介质。它们与不可渗透的双层膜协同作用，使这些病原体对许多抗生素产生内在耐药性。不同的外排系统对特定药物的影响各不相同，有些提供高水平的耐药性，有些提供低水平的耐药性；然而，外排作为一个关键的“平台”机制，使大多数其他抵抗机制能够产生影响。外排转运蛋白分为六个家族，耐药结节细胞分化(RND)家族的成员在革兰氏阴性细菌中具有最相关的临床耐药水平。作为内膜蛋白，RND转运蛋白以3:6:3的原聚体化学计量学与质周衔接蛋白(PAPs)和外膜因子(OMF)结合，形成跨越整个革兰氏阴性细胞包膜的三联复合物(图2)。RND泵可以输出广泛的结构和化学上不同的抗生素，这些泵的过度表达导致临床分离株的多药耐药性(MDR)。

由于技术的进步，特别是在冷冻电子显微镜(cryo-EM)方面，人们对RND三方系统的结构和组装的理解发生了革命性的变化。除了在原位提供完全组装的三方外排复合物之外，Cryo-EM让我们能够看到处于结合和未结合状态的外排转运体蛋白。

RND转运蛋白是一种同源三聚体蛋白，可识别配体并将来自质子(H+)梯度的电化学能量穿过内膜。PAP是一种细长的周质蛋白，通过6个PAP单体直接与内膜蛋白和OMF组分相互作用，介导三联复合物的组装和稳定。组装的复合体构成了一个连续的隧道，基材通过隧道出口。作为通道的外部部分，OMFs是外膜结合的同源三聚体结构，深入质周空间，作为三方复合物的最终管道，药物从该通道释放到细胞外空间，从而完成底物挤出。来自大肠杆菌的AcrAB–TolC在近原子分辨率下的冷冻电子显微镜结构显示，当底物不存在时，三方组装会形成封闭态复合物。在存在底物(例如嘌呤霉素)的情况下，OMF TolC的质周顶端扩张，而RND转运蛋白AcrB的三个原聚体呈松散、紧密和开放的不对称构象，可能是为药物外排做准备。与AcrB载脂蛋白到apo活性状态转变有关的四元结构变化通过PAP AcrA反映到TolC上，这也密封了泵通道以防止在底物输出期间出现泄漏。基于三联泵的最新cryo-EM结构，OMF导管的成功打开已被证明依赖于在其质周顶端由主要离子相互作用形成的α-螺旋发夹结构域以“tip-to-tip”的齿轮方式破坏“初级门”。基于P. aeruginosa的MexAB-OprM的功能和cryo-EM结构分析，还提出了PAP来加强RND过渡态之间循环的方向性。它们远不是最初被分配的简单的桥接作用，现在很清楚的是，PAPs在泵组装和基底排出中都起着至关重要的积极作用。这种重要性导致PAPs被认为是对抗外排介导的抗生素耐药性的有效靶点。

RND外排泵有助于所有临床相关革兰氏阴性病原体的MDR表型，包括大肠杆菌、铜绿假单胞菌、淋病奈瑟菌和鲍曼不动杆菌，部分原因是它们的底物范围非常大。RND转运蛋白的多特异性结构基础尚不完全清楚，尽管它们确实包含近端结合袋和远端结合袋(远端BP)，可以容纳不同的底物(图2)。在AcrB中，由于弱疏水性和弱极性残基的存在，其远端BP表面允许多位点结合。此外，AcrB的多个进入途径为具有不同化学性质的底物提供了通往远端BP的不同途径。膜-周质界面(通道1)和质周(通道2)的入口分别允许低分子量和高分质量的药物进入，而AcrB三聚体的质周和中央腔之间的开口(通道3)受到平面的、芳香族阳离子(如溴化乙锭)的青睐。最近，有人提议将位于AcrB跨膜螺旋1和2之间的第四条通道作为羧化底物(例如夫西地酸和疏水性β-内酰胺)的入口点。

AcrB的底物偏好也受到第四种跨膜组分AcrZ的影响。AcrZ位于内膜内，是一种小的α-螺旋蛋白，可与AcrB结合(图2)并通过AcrAB–TolC促进抗生素(如氯霉素、四环素和嘌呤霉素)的优先排出。最近的cryo-EM数据表明，脂质与AcrZ协同作用以变构调节AcrB活性。了解支持RND转运蛋白活性的机制将有助于合理设计外排泵抑制剂以抑制药物隔离和恢复抗生素敏感性。

外排泵的产生经过仔细调节，并且大多数系统由与结构外排系统基因相邻编码的抑制因子控制。经常观察到这些转录调节基因的突变会促进临床分离株中的泵的过表达。例如，MtrR负责抑制N. gonorrhoeaemtr唯一的RND泵MtrCDE。MtrR结合位点或其DNA结合域内的点突变很常见，并导致mtrCDE表达增加，并出现对结构多样的抗菌剂(包括青霉素、四环素、阿奇霉素和第三代头孢菌素)的耐药性。mtrCDE–mtrR位点最近被报道为多个奈瑟菌物种之间基因重组的热点，mtr区域的上位相互作用赋予了对阿奇霉素、多粘菌素B的抗性。事实上，MtrR的过表达已被证明会增加淋球菌对青霉素和头孢曲松钠的敏感性。在其他临床相关病原体中也观察到了调节因子受损与外排介导的耐药性之间的关系，包括铜绿假单胞菌、空肠弯曲杆菌和Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium。

每种RND组分的诱导表达涉及对各种环境信号作出反应的局部和全局转录调控因子。例如，S. Typhimurium中的acrAB–tolC表达由RamA调节，而RamA又受RamR的控制。最近，RamR与胆汁成分胆酸和鹅去氧胆酸共结晶，这些化合物通常存在于肝脏中并在肠道中进一步代谢；与RamR结合的配体降低了其DNA结合的亲和力，从而通过上调ramA增加acrAB–tolC的表达。RamR也被证明与其他底物相互作用，尽管方式不同，但这表明不同的识别机制允许转录调节因子对几种诱导信号做出反应。

此外，这些监管机构的活动不仅仅局限于外排监管。事实上，作为acrAB–tolC的全局调控因子，MarA、SoxS和Rob在膜完整性、DNA修复、生物膜形成、群体感应和毒力表达等方面发挥重要作用。因此，这些调节因子的多因素活动表明，外排泵表达是更广泛的基因网络的一部分，促进细菌在不同应激条件下的生存。识别外排泵表达的关键调节特征将作为对抗临床相关病原体MDR的有用治疗靶点。

RND外排泵对MDR的明显贡献，特别是在临床相关的革兰氏阴性病原体中，提供了一个明确的机会，通过靶向这些转运蛋白的结构、功能和调节来恢复药物敏感性。事实上，这也适用于其他外排家族的成员，例如金黄色葡萄球菌的NorA和结核分枝杆菌的P55。

图2 RND外排系统的结构和进入通道。a，所示为三方AcrAB(Z)–TolC外排复合物(蛋白质数据库(PDB) ID：5O66)的晶体结构。三聚体内膜耐药结节细胞分化(RND)转运蛋白AcrB在底物识别和能量转导中起着至关重要的作用。AcrB三聚体与周质衔接蛋白AcrA的6个拷贝相互作用，形成一个密封的管状结构，将AcrB连接到外膜因子TolC。AcrA六聚体环以tip-to-tip的方式与TolC三聚体相互作用。TolC三聚体是一个炮形通道，其一端插入外膜，另一端延伸到周质空间并与AcrA相互作用。小蛋白AcrZ与AcrB相互作用，并被认为在变构调节AcrB的活性中发挥作用。b，AcrB三聚体由多个底物进入通道组成(为清楚起见未显示L原聚体)。通道1(CH1)的入口通向内膜的外小叶。进入CH1的底物被引导到近端结合袋(近端BP)。CH2的入口位于由AcrB的PC1和PC2子结构域形成的裂缝处(未标明)，并向周质空间开放。高分子质量药物(例如，红霉素或利福平)优先通过CH2进入并与近端BP结合。开关环将近端BP和远端结合袋(远端BP)分开，对于将高分子质量药物从近端BP转移到远端BP很重要。低分子量药物(例如，氯霉素和利奈唑胺)优先通过CH1进入并绕过近端BP和开关环，直接与远端BP结合。CH3通向由原聚物界面之间的前庭形成的中央空腔，并优先被平面芳香阳离子(例如，小檗碱或溴化乙锭)用于直接运输到远端BP。CH4的入口位于TM1和TM2形成的凹槽处，直接通向远端BP。CH4优先被羧化药物(例如，β-内酰胺或夫西地酸)获得。在AcrB原聚体从紧密到开放(T到O)的转变过程中，所有底物通道都关闭，并在O原聚体中创建一个出口通道。出口通道连接到封闭的远端BP，允许底物输出。

3 靶点改变、修饰和保护

大多数抗生素对细菌的选择性毒性的核心是它们对重要细菌细胞靶点的高度特异性。许多抗生素以高亲和力结合一个主要靶点，这通常会抑制基本的细胞功能并导致生长抑制或死亡。如果主要靶点的结构被其他化学部分的修饰改变或保护，那么抗生素的结合就会变得低效，从而对抗生素产生耐药性(图3a)。例如，喹诺酮类抗生素通过在活性位点附近结合来抑制必需的拓扑异构酶。靶蛋白中的氨基酸替换会导致结合效率降低，但仍允许酶发挥作用，从而产生抗性。同样，编码青霉素结合蛋白(PBP)的基因突变会导致对β-内酰胺类抗生素的敏感性降低。例如，在来自印度的对氨曲南和阿维巴坦耐药的临床分离株中，已发现大肠杆菌中的PBP3突变几乎无处不在。改变的目标位点可以由生长过程中积累的随机点突变产生，并且可以在药物压力下扩展到主导地位。另外，如果细胞内存在多个拷贝，目标基因的突变等位基因可以通过等位基因之间的重组以高频率产生(例如，23S核糖体RNA(rRNA)基因同源物之间的突变和重组可以在革兰氏阳性物种中迅速产生利奈唑胺抗性)或通过转化，从而从相关物种中获得替代等位基因，并通过重组产生镶嵌基因高频地产生靶基因的突变等位基因。这种方法在有能力的物种中很常见，比如奈瑟菌属微生物。

分枝杆菌的不寻常之处在于，质粒的携带似乎很少见，并且作为AMR的一种机制，它的重要性不高。结核病的治疗需要联合治疗，异烟肼、利福平、吡嗪酰胺和乙胺丁醇是常见的一线治疗药物。对于每种药物，靶位点突变都可能导致耐药性。例如，最近的一项研究记录了对吡嗪酰胺耐药的结构基础，即PanD活性位点附近的残基突变会损害活性前药的亲和力和停留时间，从而导致耐药性。

此外，向药物靶点添加部分可以防止抗生素进入，从而保护靶点。这是一种众所周知的大环内酯类耐药机制，其中16S rRNA靶点可被核糖体甲基转移酶甲基化，从而阻止大环内酯类(以及林可胺和链阳菌素)的结合。16S rRNA的甲基化是对氨基糖苷类抗生素产生高水平耐药性的一种新兴机制。对多粘菌素的耐药性也被认为是由靶点修饰引起的。由于革兰氏阴性病原体对传统一线疗法的耐药性已经普遍增加，因此经常使用粘菌素这种老药，它是为数不多的有效药物之一。粘菌素具有复杂的作用模式，但其功效的核心是其靶向脂多糖(LPS)的能力，这会导致膜损伤和细胞死亡。通过修饰局部LPS，改变整个分子的电荷，抑制药物和靶点之间的相互作用，可以产生耐药性。通过pEtN转移酶将磷酸乙醇胺(pEtN)从磷脂酰乙醇胺转移到LPS，导致修饰后的LPS具有抗性。pEtN转移酶的作用由调节系统PmrAB或PhoPQ87控制，它们在许多革兰氏阴性物种中染色体编码，抗性突变体是垂直遗传的，但在菌株之间不共享。然而，在2015年，一种新的可移动pEtN转移酶家族被鉴定并命名为mcr(可移动粘菌素抗性)。考虑到粘菌素的重要性以及移动粘菌素耐药性快速传播的可能性，这是一个极其令人担忧的发现。随后的分析强调了一个mcr基因家族，这些基因现已在世界范围内的许多物种中得到了鉴定。MCR酶的作用方式与染色体系统相似。单独来看，获得mcr基因可能会限制粘菌素的最低抑制浓度(MIC)增加，因此mcr的临床重要性一直存在争议。在耐粘菌素分离株中携带mcr的流行率很高，携带mcr的菌株已被证明不受低水平粘菌素暴露的保护，尽管同一研究发现，携带mcr实际上抑制了粘菌素MICs非常多的突变体的选择。pEtN转移酶的表达导致副产物二酰甘油(DAG)的产生。DAG是一种可能有毒的终端代谢物；为了阻止这种情况，细胞依赖于甘油二酯激酶A(DgkA)将DAG循环成有用的前体分子。DgkA最近已被证明是粘菌素耐药所必需的，以防止有毒副产物抑制生长。总之，这些数据支持了先前的观察结果，即pEtN转移酶表达需要平衡，从而影响抗性和适应性。

对靶点的保护可能会使相关抗生素的MIC略有增加；然而，结合靶位点的突变，可以获得非常高的MIC。这在Qnr蛋白中很常见，Qnr蛋白由革兰氏阴性物种中常见的质粒上携带的基因编码，可保护拓扑异构酶免受喹诺酮类药物的抑制。仅获得一个qnr基因(现在已识别出7个家族)会产生轻微影响，但喹诺酮类耐药菌株通常会携带一个与gyrA染色体突变一致的qnr基因，这会共同导致高水平耐药性。喹诺酮类药物耐药机制的多样性(每种机制对MICs和健康的影响不同)为高水平耐药提供了许多可能的进化途径。

靶点保护也可以在不阻止药物结合的情况下发生，在这种情况下，药物到达靶点但可以减轻影响，从而产生保护。例如，耐夫西地酸的金黄色葡萄球菌通常表达FusB型蛋白。夫西地酸通过与延伸因子G(EF-G)结合来抑制翻译，核糖体易位酶参与处理mRNA和tRNAs，并在RNA易位完成后防止复合物的解离。FusB蛋白包含一个锌指结构域，即使发生了药物结合，它也能通过促进停滞复合物的解离来挽救翻译。

最近另一个拯救靶点的例子也涉及核糖体。如前所述，大环内酯类、林可酰胺类、链阳菌素靶向翻译，并通过结合肽基转移酶中心发挥作用，在蛋白质合成的延伸阶段至关重要。属于ATP结合盒F(ABC-F)家族的蛋白质可以对这些药物产生耐药性。与ABC转运蛋白相反，ABC-F蛋白不是膜结合蛋白，其成员通过与核糖体-抗生素复合物结合，提供对与核糖体肽基转移酶中心结合的抗生素的抗性。最近来自结构和遗传研究的证据表明，ABC-F蛋白包含“抗生素抗性结构域”，该结构域与靶点的药物结合结构域相互作用并导致药物释放。有不同的ABC-F蛋白质家族，现在已知它们可能在许多物种中多次进化。它们具有不同的结构，被认为对不同种类的药物具有不同的亲和力。最近基于结构和遗传数据提出Vga和Lsa ABC-F蛋白如何保护停滞的核糖体复合物的模型。该模型表明ABC-F蛋白识别停滞的核糖体复合物并与核糖体的E位点结合，然后诱导核糖体内P位点tRNA构象的转变。这允许ABC-F的抗生素抗性结构域进入核糖体的肽基转移酶中心，从而导致抗生素排出。进一步的工作已经调查了葡萄球菌中的Sal ABC-F蛋白如何对lefamulin产生耐药性的结构基础。这项研究证实Sal蛋白是导致一组葡萄球菌分离株对截短侧耳素、A组链阳菌素和林可酰胺类药物产生耐药性的原因。人们分析了SalB-核糖体复合物的结构，因此提出了一种抗性变构机制，即SalB结合改变了23S rRNA的结构并导致结合的截短侧耳素的释放。虽然截短侧耳素耐药性目前似乎很少见，但ABC-F蛋白经常出现在质粒上，这使得潜在的传播成为可能，并可能导致未来出现临床问题的耐药情况。

图3 通过靶点保护、药物失活和靶点旁路产生抗生素耐药性。靶点保护、药物失活和靶点旁路介导的抗生素耐药机制示意图。a，靶点保护机制。靶点保护蛋白可以与药物靶点结合并从空间上将药物从靶点上移除(a、i部分)。靶点保护蛋白可以结合药物靶点并介导药物与其靶点的变构解离(a、ii部分)。靶点保护蛋白可以与药物靶点结合并引起构象变化，使靶点蛋白即使在药物存在的情况下也能发挥作用(a、iii部分)。b，药物改变的机制。酶可以水解药物的官能团，从而破坏其抗菌活性(b、i部分)。酶(如乙酰转移酶、甲基转移酶或磷酸转移酶)可以通过共价转移各种化学基团来修饰药物，以防止其与靶点结合(b部分、ii)。c，靶点旁路机制。由于获得了编码替代酶的基因，药物靶点(例如酶)变得多余，该替代酶可以实现药物靶点的功能(c部分，i)。药物靶点可以被隔离药物的替代靶点取代，从而使药物靶点恢复其功能(c部分，ii)。药物靶点可能过量产生，因此没有足够的药物量来抑制增加的可用靶点(c部分，iii)。

4 药物的失活和修饰

许多致病菌耐药的普遍机制是抗菌药物本身的修饰或失活(图3b)。这通常是通过酶的作用实现的，因此通常不涉及改变细菌细胞的任何核心成分，这可以提供一个优势，因为与其他机制(如突变或药物靶点的改变)相比，相关的适应性成本不太可能出现。抗生素的修饰可大致分为两种机制：通过降解使抗生素失活或通过化学基团的转移进行修饰。由于编码基因的移动性，这两种机制在细菌中广泛存在。

4.1 抗生素失活

抗生素的失活是耐药性的一个主要机制，由此药物的结构被破坏或降解，从而降低其效力；因此，它会导致临床治疗成功率降低。抗生素失活的例子包括β-内酰胺抗生素被β-内酰胺酶水解、四环素羟化酶结合使四环素失活。β-内酰胺酶是一种酶，通过水解β-内酰胺环上的酰胺键，从而降解药物，对β-内酰胺类药物产生耐药性。自20世纪40年代以来，β-内酰胺酶已经在自然界中进化，以响应微生物产生β-内酰胺抗生素。已表征的β-内酰胺酶的列表不断增加；在撰写本文时，β-内酰胺酶数据库记录了7000多种不同的β-内酰胺酶。目前已经开发了两种主要的β-内酰胺酶分类方案，基于Ambler类别中的序列或功能。在功能上，有四类β-内酰胺酶(A–D)；A、C和D类是丝氨酸β-内酰胺酶，B类成员是锌依赖性金属-β-内酰胺酶。

碳青霉烯类耐药尤其令人担忧，因为碳青霉烯类是目前使用的最有效的抗生素之一，碳青霉烯类耐药结合对其他β-内酰胺类耐药可排除一整类药物。超广谱β-内酰胺酶提供对超广谱头孢菌素和单环内酰胺类的抗性。碳青霉烯类耐药可由碳青霉烯酶介导，或通过产生超广谱β-内酰胺酶并结合孔蛋白损失来介导。2017年，世卫组织列出了3种“关键”重点病原体，它们均对碳青霉烯类耐药。碳青霉烯酶，如KPC(A类)、NDM(B类)和OXA(D类)，能够水解青霉素、头孢菌素和碳青霉烯类，大大减少了针对特定感染的药物治疗选择数量。碳青霉烯酶的新变体不断被发现，例如KPC-55，它在催化氨曲南和美罗培南时特别有效，NDM-19即使在低锌条件下也能水解β-内酰胺，以及Acinetobacter calcoaceticus中的OXA-679，赋予对碳青霉烯类的高水平抗性。在碳青霉烯酶中，NDM酶在过去十年中对耐药性产生了巨大影响。它们于2009年首次在印度被发现，由于它们存在于多种不同的质粒上，现在在全球几个不同的物种中都有发现，并且它们可以赋予对除氨曲南以外的所有β-内酰胺类药物产生抗性。结果表明，同一医院重症监护病房内的不同物种经常共享抗生素耐药基因，其中，β-内酰胺耐药基因最常见，超过40%的物种具有预测的碳青霉烯酶活性。这项研究和其他研究显示了β-内酰胺酶在细菌之间传播的频率。多药耐药质粒通常以β-内酰胺酶的存在为特征，使这些基因更容易在不同细菌之间传播。除了质粒外，β-内酰胺酶也经常在插入序列附近被发现。这既可以调动抗性基因又可以影响其表达水平。例如，在鲍曼不动杆菌中，插入序列ISAba 1位于blaampC基因(编码AmpC β-内酰胺酶)的上游，增加了其表达，进而提供了对超广谱头孢菌素的抗性。

抗生素失活的另一个重要例子是催化四环素氧化的四环素失活酶。最著名的是Tet(X)家族，它在许多不同种类的细菌中都有特征，并且可以在转座元件上水平移动，赋予高水平的四环素抗性。tet(X/X2)基因广泛传播，常见于来自各种环境的多药耐药细菌，包括从患者身上分离的细菌，并且它们在环境中的存在与四环素的使用呈正相关。Tet(X3/X4/X5)酶可产生对替加环素的耐药性，并且在中国的肠杆菌和不动杆菌分离株中均发现了Tet(X3/X4/X5)酶。虽然Tet(X)酶具有赋予耐药性的能力，但它们降解四环素的能力各不相同。结构分析比较了家族中不同酶降解底物的能力，并建议在最有效的酶中进行确定的替换可以减少周转时间，从而更快地处理底物。

4.2 通过转移化学基团对抗生素进行修饰

化学基团的转移也可以使抗生素失效。已经鉴定了几种抗生素的药物修饰酶，包括氨基糖苷类、大环内酯类、利福霉素、链阳菌素、林可酰胺类和氯霉素类。

氨基糖苷类可以通过乙酰转移酶、磷酸转移酶或核苷酸转移酶进行修饰，修饰药物的羟基或氨基，这反过来会大大降低药物对靶点的亲和力。除了染色体之外，许多氨基糖苷类修饰酶都编码在可移动的遗传元件上，并且在革兰氏阳性和革兰氏阴性物种中都发现了它们。最近的一个新型氨基糖苷修饰酶的例子是ApmA，它是一种能够使安普霉素失活的乙酰转移酶，安普霉素是一种目前可以逃避其他氨基糖苷耐药机制的抗生素。

林可酰胺类抗生素可以通过核苷酸转移酶进行修饰，它将含磷酸基团添加到抗生素中。核苷酸转移酶由lnu基因编码，例如在葡萄球菌属中的lnu(A)。新的lnu基因仍在鉴定中，虽然它们的临床影响仍不确定，但令人担忧的是，它们通常可以在具有跨许多不同细菌传播能力的移动遗传元件上发现。

磷酸转移酶和酯酶可以修饰并赋予对大环内酯类的抗性，因为修饰后的大环内酯类不能有效地结合50S核糖体。大环内酯磷酸转移酶的结构已被阐明，表明它们与氨基糖苷磷酸转移酶属于同一个蛋白质超家族。酯酶是一组不同的修饰酶，酯酶-大环内酯复合物的结构尚待解析。

氯霉素和链阳菌素抗生素通常都被广泛存在的乙酰转移酶修饰。氯霉素乙酰转移酶(CAT)将乙酰基转移到辅酶A，防止氯霉素与其在核糖体上的靶点结合。链阳菌素抗生素根据其结构可分为两组：A组与肽基转移酶中心结合，B组与肽出口通道结合。链阳菌素被Vats酶修饰，使酒精乙酰化，改变蛋白质的构象，从而降低抗生素的活性。最近的一项研究开发了一条管道，专门用于寻找受Vats影响较小的新型链阳菌素抗生素，这对于开发此类更有效的药物可能很重要。

最后，利福霉素可以被ADP-核糖基转移酶、糖基转移酶、磷酸转移酶和单加氧酶灭活和修饰。利福霉素通常是对抗结核分枝杆菌感染的第一道防线。Mycobacterium smegmatis中的ADP-核糖基转移酶在20世纪90年代末首次被鉴定，但最近也发现了ADP-核糖基转移酶，使Mycobacterium abscessus具有高水平的利福霉素抗性。在撰写本文时，还没有在结核分枝杆菌中鉴定出ADP-核糖基转移酶。ADP-核糖基转移酶催化ADP核糖转移至抗生素上的羟基连接C23，从而阻断其与RNA聚合酶的相互作用。糖基转移酶对利福霉素的抗性与ADP-核糖基转移酶的作用相似，即酶糖基化C23的羟基位置。磷酸转移酶在C21将利福霉素转化为无活性的磷酸化利福霉素。如果在可移动遗传元件(如质粒)上发现磷酸转移酶，则此类酶的表达有可能降低生物体的易感性特征。最近，一种由利福霉素单加氧酶(Rox)赋予利福霉素失活的新机制被描述。Rox酶已被证明在萘基氧合后线性化利福霉素结构，这取消了药物与RpoB的结合。

5 靶点旁路

靶点旁路是一种策略，包括产生一种替代途径，通过使原始目标冗余来绕过抗生素。这可以通过获得替代基因来实现，该替代基因可以赋予细胞所需的特性，但不会被原始抗生素有效抑制(图3c)。

靶点旁路最著名的例子可能是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的发展。β-内酰胺类抗生素，如甲氧西林，与PBPs结合并抑制转肽酶结构域，导致细胞壁合成中断。金黄色葡萄球菌可以获得与原靶点同源但对β-内酰胺类抗生素亲和力较低的外源性PBP(PBP2a)。该蛋白由mecA基因编码(甲氧西林耐药基因)，位于葡萄球菌盒染色体mec(SCCmec)，是一个赋予甲氧西林耐药的可移动遗传元件。

当甲氧西林与这个替代靶位点结合时，由于PBP2a的转肽酶活性得以维持，细胞壁合成的抑制被阻止。由于PBP2a不具有转糖基酶结构域，因此还需要天然PBPs。通过这种机制，金黄色葡萄球菌可以绕过甲氧西林的作用以确保细胞存活。最近的证据表明，在人类感染中常见的MRSA谱系最初出现在欧洲刺猬身上，是对内源性皮肤真菌产生的β-内酰胺的反应。这远早于人类使用抗生素，说明了在不同情况下运行的选择压力的广泛多样性，这可能对人类健康产生影响。

最近发现的另一个靶点旁路的例子是在大肠杆菌中，其中另一种交联机制的产生，包括L,D-转肽酶YcbB，可以绕过PBPs的D,D-转肽酶活性，导致β-内酰胺耐药性。在此示例中，除了YcbB的L,D-转肽酶活性外，还需要其他因素，例如alarmone(p)ppGpp的高水平合成，C类单功能PBP5和A类PBP1b的糖基转移酶活性。虽然YcbB不受β-内酰胺类抗生素的抑制，但它仍然对美罗培南和亚胺培南等碳青霉烯类抗生素敏感。

万古霉素是一种糖肽类抗生素，广泛用于治疗肠球菌和MRSA感染。该药物还抑制细胞壁合成，但它不像β-内酰胺那样直接与PBPs结合，而是与来自五肽前体的末端D-丙氨酸-D-丙氨酸结合。这会抑制肽聚糖交联，而肽聚糖交联对于细菌细胞壁的合成至关重要。肠球菌的万古霉素耐药性是通过获得van簇介导的，其中vanA基因簇在临床万古霉素耐药菌株中最为普遍。位于转座子(Tn1546)上的vanA基因簇的基因表达导致肽聚糖前体的异常合成，这是靶位点。因此，万古霉素不再与D-丙氨酸-D-丙氨酸结合，而是以降低的亲和力与末端D-丙氨酸-D-乳酸或D-丙氨酸-D-丝氨酸结合。这种旁路策略使肠球菌和其他革兰氏阳性细菌对万古霉素产生耐药性。一些MRSA菌株还可以携带从耐万古霉素粪肠球菌获得的Tn1546转座子。这导致出现了由vanA基因簇赋予的万古霉素耐药性的MRSA，2002年美国报道了第一例病例。虽然耐万古霉素金黄色葡萄球菌感染很罕见，但在欧洲分离出了耐甲氧西林和耐万古霉素金黄色葡萄球菌菌株。

两种抗生素甲氧苄氨嘧啶和磺胺甲恶唑的组合通常用于治疗尿路感染和预防卡氏肺囊虫引起的肺炎，这种肺炎发生在HIV感染者身上。这两种活性剂可阻断细菌叶酸的生物合成，而叶酸是核酸和蛋白质合成所必需的。TMP是二氢叶酸还原酶(DHFR)抑制剂，而SMX是一种磺胺类药物，可抑制二氢叶酸合成酶DHPS。一般来说，联合疗法出现耐药性的速度较慢，这使其成为一种有吸引力的策略。然而，当获得和/或过度产生额外的DHFR和/或DHPS新等位基因时，就会发生对TMP-SMX的耐药性。这导致靶点可用性的增加和TMP-SMX结合活性的降低，维持叶酸的生产并确保细胞存活。

细菌具有不同的方式来回收其自身细胞壁的成分。在大肠杆菌中，MurNAc-6醚酶(MurQ)用于回收尿苷二磷酸(UDP)N-乙酰胞壁酸(UDP-MurNAc)，这是肽聚糖从头生物合成的第一个前体。然而，氨基糖循环和分解代谢所必需的MurQ酶在许多革兰氏阴性菌中缺失。据报道，在大多数革兰氏阴性菌中(大肠杆菌中没有)有一种“合成代谢循环途径”，它绕过了肽聚糖生物合成的第一步。该循环途径以UDP-MurNAc的形式将MurNAc-6P直接引入肽聚糖生物合成。由于UDP-MurNAc池受到影响，磷霉素(MurA)的靶点(存在于肽聚糖生物合成的第一步)也被改变。因此，这一途径也提供了对磷霉素的内在抗性。

6 耐药破坏者的承诺

了解耐药分子机制的一个重要原因是利用这些信息来设计干扰或抑制耐药机制的新策略。所谓的抗生素抗性破坏剂是可以破坏或抑制特定抗生素抗性机制以恢复特定抗生素临床疗效的化合物。这是一个有吸引力的策略，因为它可以用来加强现有抗生素的使用，并且有广泛的原理证明该策略在临床上有效，因为自从1981年将克拉维酸引入临床以来，β-内酰胺酶抑制剂已被成功使用。通常，β-内酰胺酶抑制剂通过修饰β-内酰胺酶，使其失去活性来发挥作用。许多化合物，包括克拉维酸、舒巴坦和他唑巴坦，本身就是具有最小抗菌作用的β-内酰胺化合物，但具有修饰β-内酰胺酶的能力，从而产生无活性的抑制酶复合物。最近，已开发出属于重氮双环辛烷类(例如avibactam、relebactam和durlobactam)或硼酸类(vaborbactam)的新型β-内酰胺酶抑制剂，并获得了监管批准，用于美罗培南-vaborbactam、亚胺培南-relebactam，显示出可行的临床潜力。尽管β-内酰胺酶抑制剂取得了巨大成功，但现在耐药性问题日益严重；正如所有临床可用的抗生素都有耐药报告一样，现在也有对所有可用的β-内酰胺-β-内酰胺酶抑制剂组合的耐药报告。耐药性通常由目标酶的高水平表达或酶的突变介导。虽然尚未进入临床应用，但有前景的氨基糖苷修饰酶抑制剂也已经被开发出来。

对耐药机制如何与核心生理学相互作用的深入了解也提供了机会，例如，观察到pEtN转移酶引起的粘菌素耐药会作为副产物产生有毒的DAG，而DkgA可以缓解这种情况。失去这种控制机制会导致pEtN转移酶的抑制和抗性的丧失；因此，靶向DkgA可以增强粘菌素活性。

另一种耐药破坏策略是针对不渗透的革兰氏阴性外膜，以增加药物摄取。然而，具有这种作用的化合物本身通常具有杀菌作用，同时还能增强其他抗生素的活性。例如，包括粘菌素在内的多粘菌素是有效的抗菌剂，通过渗透细胞膜发挥作用，但有证据表明，它们可以与其他抗菌肽一起与其他药物联合使用以提高活性。

最后，抑制外排泵活性的概念特别有吸引力，不仅是因为外排是许多其他耐药机制的基础，还因为毒力和生物膜形成也需要许多外排泵。这个想法是，通过阻断或以其他方式抑制主要的外排泵，抗生素的敏感性会增加，因为抗生素的排出会被阻止，导致它们在细胞内积聚到高水平。已经发现或开发了几种RND外排泵的竞争性抑制剂。然而，主要由于宿主毒性，没有一种已经进入临床。竞争抑制也因系统的复杂性而复杂化，因此，这种方法有可能最终不成功。事实上，似乎可能需要采用替代策略来抑制排出；正在探索的其他策略包括防止排出复合物组装，靶向外膜或质周成分，解耦能量源，或抑制外排泵表达。此外，最近的研究表明，外排对药物积累的影响在活跃生长的细胞中最为明显，这表明应该针对特定类型的感染开发外排抑制剂。

除了β-内酰胺酶抑制剂的广泛应用，耐药抑制剂的前景尚未得到临床应用。上面列举的例子表明，理解抗性生物学可能有助于未来组合的发展；然而，这是复杂的，临床产品的开发将需要付出巨大的努力。

结论和未来展望

AMR的流行病学继续描绘出一幅令人担忧的画面，其威胁正在加速。然而，许多研究人员对这个问题不同方面的研究给了我们一些希望。我们现在对不同抗生素如何起作用的生物化学原理和相应的耐药机制有了更多的了解。随着对耐药性的选择和对宿主适应性的影响有了更深入的了解，我们可以更好地为任何新的药物制定给药方案，以最大限度地减少耐药性的出现。了解耐药性的遗传基础也是正在开发的各种快速诊断方法的基础，这些方法有望指导最初的抗生素选择，以最大限度地减少无效抗生素的使用。最终，迫切需要新的抗生素或新的协同治疗组合，而了解耐药性是这些努力的先决条件。