基因治疗为传统疗法无效的疾病提供了可选择的治疗方案。自2016年以来，欧洲药品管理局（European Medicines Agency，EMA）和美国食品药品管理局（Food and Drug Administration，FDA）已批准总共6种基因治疗产品：2种用于治疗B细胞癌的嵌合抗原受体T细胞产品和4种用于治疗严重单基因疾病的产品，上述单基因疾病包括β地中海贫血、一种罕见的视力减退、脊髓性肌萎缩和一种罕见的原发性免疫缺陷。因此，基因治疗的最早证据来自目前已获得上市许可的药物。目前有800多种细胞和基因治疗项目正在临床开发中（其中包括进行性假肥大性肌营养不良和亨廷顿病等既往无法治疗的疾病），因此随后可能将出现更多的治疗方法。我们在本文中综述了该领域目前的状况，重点关注单基因疾病（见交互式图形，该图形可在NEJM.org获取）。
基本原理
对遗传病采取基因治疗的目标是实现治疗性基因或“转基因”的持久表达，在最少不良事件的前提下使其水平足以改善或治愈疾病症状。有两种基本策略：将整合载体导入前体细胞或干细胞内，从而使基因可以传给每个子细胞（载体被设计为可以在患者染色体的一个或多个基因座整合），或者通过非整合载体将基因递送到长期存活的有丝分裂后细胞或缓慢分裂的细胞内，从而确保该基因在细胞存活期间持续表达。后面一种情况不需要将治疗性DNA整合入患者细胞的染色体内；而是转移的DNA在染色体外达到稳定。干细胞转导通常为离体操作，并且需要整合载体，而将基因递送给长期存活的有丝分裂后细胞的过程通常是通过体内基因递送的方式实现。
离体，体内
进行离体转导时，我们从患者体内提取细胞并对所需的基因进行转导，然后采用与造血干细胞移植相似的操作将细胞回输到患者体内（但在这种情况下，移植物是由经基因修饰的自体细胞构成）（图1）。这种方法需要基因递送载体、构成基因本身的DNA和用于处理细胞的精密设备。而体内基因递送与其他类型药物的递送方式相似（图2）。载体-基因构建物被冷冻保存；之后由药剂师解冻和制备，并且一般在门诊给药。
图1. 基因治疗的离体递送
离体递送基因治疗的一个例子是β地中海贫血的治疗，包括将基因转入造血干细胞和祖细胞（HSPC）内。这些细胞是从患者骨髓或经过动员的外周血中采集，并通过亲和柱分离出CD34+ HSPC。我们在有生长因子的情况下对HSPC进行离体培养，从而使自我更新的干细胞得以维持和扩增，之后采用在红细胞特异性启动子控制下编码β-珠蛋白互补DNA的整合慢病毒载体进行基因转移。患者接受预处理方案，该方案清除骨髓中的内源性HSPC，并在骨髓微环境中创造供离体工程细胞植入的空间。之后，经基因矫正的HSPC通过静脉回输到患者体内并植入骨髓，它们可以在骨髓中自我更新并分化成各造血谱系。然而，由于载体的设计，β-珠蛋白基因的表达仅限于红系。
图2. 基因治疗的体内递送
体内基因治疗的一个例子是治疗由RPE65功能丧失型变异体引起的视力减退，RPE65负责编码将全反式视黄酯转化为11-顺式视黄醇的酶，这一过程是发生于视网膜色素上皮内的视觉周期的一部分。通过神经视网膜下注射的方式递送腺相关病毒（AAV）载体中的基因，方法是行玻璃体切割术，之后在手术中直接注射。注射悬浮在液体中的载体，在视网膜下方产生一个假腔（“水泡”），载体于此转导视网膜色素上皮（RPE）细胞。转基因保持附加体状态；不整合入细胞DNA。
要将基因治疗应用于遗传病，我们需要做的绝不仅仅是确定致病基因。转基因（或其蛋白质产物）必须被递送到生理上相关的一个或多个靶组织，必须稳定表达，并且绝不能干扰这些细胞的功能完整性。
安全性
在获得基因治疗的临床经验之前，研究者已确定了其理论上的潜在风险（表1）。临床数据对这些风险进行了修正和排序，目前我们已经明确，整合载体（例如逆转录病毒载体）的主要风险来自其插入诱变潜力，即载体插入细胞DNA并破坏该DNA的功能元件（例如基因）1-4。对于体内给药的载体，主要风险来自对载体的免疫应答，如下文所述5-10,14,15。插入诱变风险已通过制造更安全的（慢病毒）载体来降低或规避，免疫应答风险已通过辅助性免疫调节药物来降低16。推动我们做出这些调整的是在早期失败或非预期不良事件指导下开展的研究6,17,18。
表1. 基因治疗的潜在并发症和观察到的并发症*
* AAV表示腺相关病毒，SCID表示重度联合免疫缺陷。
慢病毒和腺相关病毒（AAV）载体不具有持续复制的能力。理论上，如果载体和野生型病毒同时感染同一组织，或者如果复制型病毒污染载体制剂，则野生型复制型病毒可能被重构或动员19。因此，必须对每个批次进行复制型病毒检测。
离体基因治疗
重度联合免疫缺陷——吸取的教训
2016年，采用造血干细胞和祖细胞（HSPC）进行的离体基因治疗达到了一个里程碑，当时EMA批准了Strimvelis（Orchard Therapeutics）用于治疗腺苷脱氨酶（ADA）缺陷型重度联合免疫缺陷（SCID），这是一种通常对幼童具有致死性的疾病。具体方法是采用γ-逆转录病毒载体插入ADA基因的功能性拷贝，然后将经过上述基因修饰的自体HSPC输入患者体内20-22。
20多年前，在ADA缺陷型SCID患儿中对γ-逆转录病毒载体开展的首项离体基因治疗研究未获成功，原因是经基因矫正的HSPC数量少23,24。2016年的试验取得成功（ADA持续长期生成，患者有持续治疗获益）有赖于移植前应用小剂量白消安进行了旨在清除细胞的预处理（从而使植入的基因矫正干细胞达到更高水平），以及未采用酶替代疗法（从而有利于基因矫正细胞的扩增）20,21。该试验还显示了长期安全性22。在过去10年间，我们已经明确，为了实现长期治疗获益，必须为经基因修饰的自体干细胞打开骨髓微环境并创造空间。遗憾的是，清髓所需的化疗具有毒性，会增加继发性肿瘤或骨髓衰竭的发生风险。基于抗体的预处理方案等替代策略目前正在研究中25,26。
用于治疗另一种SCID27-29的另一种早期方法是使用γ-逆转录病毒载体迫使IL2RG（编码共同γ链）在自体HSPC中离体表达，上述HSPC移植回患者体内后可使其免疫功能恢复，这清楚地证明了基因治疗的临床疗效。遗憾的是，试验中的某些参与者患上了T细胞白血病，进而需要接受大剂量化疗和骨髓移植1,2，这促使人们寻找更安全的载体30-33。
慢病毒载体在细胞周期的静止G0期或G1期高效转导造血细胞34，并且在人类基因组中具有比γ-逆转录病毒载体更安全的整合模式35。然而，如何对慢病毒载体进行临床规模制备仍然是一个难题。尽管有这个困难，但基于慢病毒，用于治疗原发性免疫缺陷、代谢疾病和遗传性血液疾病的离体试验仍在进行中36-41。
由于慢病毒载体的转导效率较高，因此经基因矫正的HSPC已用于治疗肾上腺脑白质营养不良和异染性脑白质营养不良。在这些常染色体隐性遗传的溶酶体贮积症中，经基因矫正的细胞迁移到脑部，并“交叉矫正”含有突变基因的细胞：经基因矫正的细胞合成并分泌关键蛋白质，然后上述蛋白质被未经基因矫正的细胞吸收和利用。然而，为了使基因转移在再植干细胞中达到治疗水平，我们需要达到以下几点：完全清髓、较高的病毒拷贝数或转基因的超生理表达38,39,42。
地中海贫血和镰状细胞贫血
由于珠蛋白基因的表达受到复杂调节，因此用于地中海贫血和镰状细胞性贫血的基因治疗30多年来一直是难以实现的目标43。纳入严重β地中海贫血患者的最初的基因转移试验显示了可行性，但并无持久的临床获益，原因是除了一例患者不再依赖输血（原因是居优势地位，偏向髓系分化的细胞克隆）之外，大多数患者未能植入足量经基因矫正的干细胞44,45。
最近，β地中海贫血患者干细胞基因治疗的1期和2期试验显示了其安全性和患者输血频率降低41,46。临床疗效与基因转移效率、转导细胞中的前病毒平均拷贝数以及经基因矫正的造血干细胞剂量相关，与血红蛋白合成需求呈负相关。这两项试验之一41以及正在进行中的3期研究（关于编码变异βA-T87Q-珠蛋白基因的载体）表明，患者在长达56个月期间不需要输血，这被视为持久疗效；因此EMA有条件地批准了Zynteglo（蓝鸟生物）用于治疗≥12岁，且不属于β0/β0基因型的输血依赖型β-地中海贫血患者47。靶向不同基因、利用不同载体治疗镰状细胞性贫血的4项基因治疗试验正在进行中（ClinicalTrials.gov注册号为NCT03282656、NCT02247843、NCT02186418和NCT02151526）。
体内基因治疗
研究者已经利用一系列基因递送载体对单基因疾病进行了体内基因转移（将载体直接注射到患者体内）研究；目前大多数研究应用的是AAV载体。重组AAV载体是利用一种非致病性无包膜细小病毒构建而成。制备载体的方式是将由适当启动子驱动的治疗性基因置于两个非编码病毒包装信号之间（图2）48。当序列长度超过5 kb时，将转基因包装入载体中的效率急剧下降，这是AAV载体递送系统的少数几个局限性之一49。大部分AAV载体DNA在细胞内以稳定附加体的形式持续存在（未整合入患者基因组）。因此，AAV载体发生插入诱变的风险低。
注射大剂量AAV载体的新生小鼠所出现的肝细胞癌向我们发出了危险信号50。随后的研究表明，插入诱变的发生风险具有剂量依赖性，并且新生小鼠的这一风险较高，因为小鼠肝脏中发生快速细胞分裂并伴有相对频繁的染色体断裂，而这些是AAV载体整合的优选位点51,52。目前尚未在临床研究中观察到肝细胞癌，但将AAV载体应用于婴儿的经验有限，因此我们需要继续进行监测。
早期临床研究发现，人体免疫应答对AAV疗法的全身性给药构成了障碍6。许多人曾暴露于野生型AAV，因此体内既有针对AAV的循环抗体，也有衣壳特异性记忆T细胞53,54。设计出可规避原有抗体中和作用的方法以及控制细胞免疫应答是成功实现更广泛临床应用的关键55。
alipogene tiparvovec（Glybera，uniQure）是首个商业化AAV载体产品，也是针对遗传病的首种基因治疗，该产品于2012年获得EMA批准，治疗人群是患罕见遗传性血脂异常，即脂蛋白脂肪酶缺乏症的患者，用于治疗该人群的复发性或重度胰腺炎。由于对该药物的商业需求较低，因此药物审批文件于2017年到期时，制造商未申请更新。但该药物的获批确定了AAV产品可达到监管要求，因而提高了人们对其他AAV载体产品的开发兴趣（表2）。
表2. 基因治疗的监管审批里程碑*
* ALL表示急性淋巴细胞白血病，cDNA表示互补DNA，EMA表示欧洲药品管理局，FDA表示美国食品药品管理局，IND表示试验性新药，NIH表示美国国立卫生研究院，NMPA表示中国国家药品监督管理局。
† 载体名称表示载体类型（腺相关病毒[AAV]、腺病毒[Ad]、单纯疱疹病毒[HSV]、慢病毒[LV]或逆转录病毒[RV]）和转导的基因。
‡ 药物审批文件于2017年到期时，制造商未申请更新。
视力减退
最近，美国FDA和EMA均批准了另一种AAV载体产品voretigene neparvovec-rzyl（Luxturna，Spark Therapeutics），用于治疗由RPE65（RPE65编码一种对视觉周期至关重要的酶）突变引起的一种罕见的、常染色体隐性遗传的失明。如果不接受治疗，大多数患者的病情最终会发展到完全失明，并且许多人从出生起就有视觉障碍56。在载体介导的基因转移领域，视网膜是一个引人关注的靶点，原因是它是一个相对“免疫豁免”的部位（即该组织可以耐受引入的抗原，而不产生炎性免疫应答），而且较低的载体剂量对药物制备带来的负担较小。AAV载体可以在门诊手术中进行视网膜下注射给药（图2）。对天然存在的RPE65缺陷犬模型开展的研究给出了令人信服的概念验证（治疗恢复了犬的视力）57,58，数个研究组开展的早期临床试验也显示了视力改善的证据59-61。这些研究是对基因治疗开展随机对照3期试验的基础：患者接受药物治疗后，功能性视觉有所改善，全视野光敏度和视野也有所增加62。4年随访提示治疗效果持久63。然而，其他1期和2期试验仅记录到短暂效果，最早在注射载体后1年即出现疗效丧失10,16,64。voretigene neparvovec-rzyl的获批推动人们采用类似方法治疗其他先天性失明，针对各种遗传性视网膜营养不良的试验目前正在进行中65-68。
全身性递送、血友病和免疫应答
以肝脏或其他器官为目标对AAV载体进行的全身性血管内给药已经在数种重度遗传病中获得了正面的临床结局。对重组AAV载体血管内给药开展的一项早期试验纳入了男性重度血友病B患者。该试验确定了两个主要的免疫障碍：存在于20%～40%成人体内的AAV抗体，它可中和载体，进而降低疗效；以及在输入载体后4～12周发生的对AAV衣壳的迟发型细胞免疫应答，它会导致转导细胞遭到破坏和丧失疗效6。上述两个问题的根源是人类是野生型AAV的天然宿主，因此可能携带儿童期呼吸道感染后产生的抗体或记忆T细胞。
第一个问题的暂时解决方案是将有抗体的患者排除在治疗之外：我们显然需要更好的解决方案。迟发型细胞免疫应答6的临床表现是无症状、自限性的转氨酶水平升高，同时来自转基因的因子Ⅸ表达逐渐完全丧失。对外周血单核细胞所做的检测表明，它们针对AAV衣壳肽分泌γ干扰素，因此人们提出以下假设：通过药物进行免疫抑制可能有助于AAV载体发挥疗效，因为衣壳肽的存在时间应该很短6。这一假设在第二项试验中得到了证实，该试验中发生转氨酶水平升高或因子Ⅸ水平降低的参与者接受了逐渐减量的糖皮质激素疗程69。试验中输入最大剂量糖皮质激素的6名参与者在3年观察期内表现为因子Ⅸ长期表达，并且出血事件和因子Ⅸ用药量均减少90%70。之后的一项试验采用了因子Ⅸ71的高比活性变异体，因而可以采用较小剂量（早期试验中所采用的大剂量的1/4），并且达到的因子Ⅸ平均活性水平要高得多，而免疫应答的发生率较低12，这可能是因为免疫应答具有剂量依赖性。
由于可以整合入AAV载体的互补DNA（cDNA）长度存在限制，因此对于由F8（一个非常大的基因）突变引起的血友病A，研究者花了比较长的时间才启动针对基因治疗的临床试验。正在进行中的临床试验利用了编码截短因子Ⅷ的cDNA。其中一项试验最近取得了结果：前9例患者的报告显示，在接受最大剂量载体的7名男性中，20周时有6名的因子Ⅷ活性水平为12%～200%以上（50%～150%代表正常活性水平）7，但上述活性水平随时间推移而下降（随访3年以上）72。因子Ⅷ水平的下降，以及因子Ⅷ的错误折叠倾向（错误折叠可能导致细胞应激）令人质疑血友病A患者可否实现持久应答。尽管如此，在2～3年内观察到的患者年出血率的降低仍然是稳健的。
所有这些研究中的安全性数据令人鼓舞。与载体相关的观察结果（包括体液内有载体DNA）均为一过性，而且不良事件（如无症状的转氨酶水平升高）经逐渐减量的糖皮质激素治疗后一般有效。应用AAV载体介导的基因转移治疗血友病的3期试验目前正在进行中（NCT03370913、NCT03861273和NCT03569891）。
脊髓性肌萎缩
AAV全身性给药的另一个成功应用是治疗脊髓性肌萎缩，这是一种由编码运动神经元存活（survival motor neuron）蛋白-1的SMN1突变引起的疾病。该病根据发病年龄和严重程度分为四种亚型。1型脊髓性肌萎缩是导致婴儿死亡的最常见遗传性原因。死亡或需要机械通气（每天至少16小时，为期至少2周）的中位年龄是10.5月龄73。2016年，美国FDA批准反义寡核苷酸（nusinersen [Spinraza, Biogen]）用于治疗该疾病。该药物需要反复鞘内给药。2017年，研究者报告了15名1～8月龄婴儿单次静脉注射表达SMN1的AAV9载体后获得的结果，2019年，该治疗获得美国FDA批准8,74。虽然转导目标是脊髓运动神经元，但由于SMN1的普遍表达，对其他组织的细胞进行转导可能也有益。最初试验中的全部15名婴儿在20月龄时均存活，并且不需要通气支持，此外在较大剂量队列的12名儿童中，有11名可在无须协助的情况下坐着，9名可翻身，11名可经口喂食和讲话。试验报告了2起4级不良反应，不良反应均为转氨酶水平升高（AAV载体全身性给药引起的最常见不良事件），并且经糖皮质激素治疗后缓解。试验扩大到100多名婴儿和儿童之后总体证实了上述结果。但试验中出现了两例死亡，一例与基础疾病进展相关，另外一例仍在等待尸检结果75。
未来考虑事项
监管领域的两项转变为基因治疗这一类治疗方法继续发展成熟提供了支持。第一项转变是美国国立卫生研究院（NIH）院长Francis Collins和前FDA局长Scott Gottlieb近期宣布，NIH重组DNA咨询委员会（NIH Recombinant DNA Advisory Committee）和FDA的双重审查制度运行多年之后，基因治疗的试验性新药今后将完全由FDA负责审查，与其他类别的治疗方法一致76。另一项转变是FDA组织和先进治疗办公室（Office of Tissue and Advanced Therapies）于2018年发布了6份新的指南文件草案，基因治疗领域在最佳临床前、临床和制备方法方面经验逐渐增长，也达成了一些共识，上述指南文件草案根据这些经验和共识综合并规范了多种疾病靶点的研究方法77。
有人已经提出基因治疗的费用可能阻碍其发展，使之无法成为商业上可行的治疗方法。所有细胞和基因治疗都面临的一个挑战是，这些“一次性”的高价值疗法面对的是围绕长期用药的药物所设计出的报销制度。大多数人都会同意以下观点：如果结局相似，则单次给药的治疗优于必须反复给药的治疗。因此，人们期望这些一次性疗法的长期益处可证明其高昂费用的合理性。举例来说，这一点在血友病治疗中是显而易见的，血友病目前的标准治疗是凝血因子替代疗法，每位患者每年的费用可能高达40万美元甚至更高。基因治疗的进展为之前无药可医的多类疾病带来了新的治疗方法，但医疗系统不会获得直接的费用补偿。因此，我们需要解决这些创新疗法的付费问题。目前已经为某些基因治疗产品设立了基于结局的折扣制度，即如果未达到预先设定的治疗结局，则制造商提供一定的折扣。也有人提出在疗效持续期间每年支付费用。
对于离体基因治疗，未来的目标包括改进慢病毒载体的设计（旨在进一步提高安全性和转基因控制），高效大规模制备并分析鉴定载体，以及开发毒性较低且有助于基因矫正干细胞稳定植入的预处理方案，包括用基于抗体的方案代替化疗预处理，从而减少并发症25,26。对于应用AAV载体进行的体内基因治疗，未来10年的努力将集中于阐明和管理人体对载体的免疫应答，并继续改进AAV载体的设计和开发，从而提高靶向能力并采用较小剂量达到体内疗效78。
总之，基因治疗的进展为许多迄今无法治愈的疾病带来了令人兴奋的新治疗机会。然而，要克服这类新型药物带来的挑战并实现其全部治疗潜力，我们仍需要强有力且持续的合作努力。
Disclosure forms provided by the authors are available with the full text of this article at NEJM.org.
This article was updated on August 1, 2019, at NEJM.org.
译者：侯海燕，NEJM医学前沿
校对：照日格图，NEJM医学前沿
Katherine A. High, M.D., and Maria G. Roncarolo, M.D.
From Spark Therapeutics, Philadelphia (K.A.H.); and Stanford University, Stanford, CA (M.G.R.). Address reprint requests to Dr. High at Spark Therapeutics, 3737 Market St., Suite 1300, Philadelphia, PA 19104, or at kathy.high@sparktx.com.
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