基因组编辑是一组精度达到单个碱基对，用于改变细胞DNA的方法。它是一种特殊类型的基因疗法，通过基因组编辑进行的细胞工程有可能创造出一类治疗遗传病和非遗传病的新药。基因组编辑已进入临床试验阶段：应用包括纠正导致单基因疾病的变异、增强嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法，以及基于细胞的再生医学。在本文中，我介绍了基因组编辑的发展，并讨论了在这一过程中，疗效、特异性、输送和安全性所不可或缺的作用（见交互式图表，可在NEJM.org获取）。
基因组编辑的早期发展
1994年之前，哺乳动物细胞的基因组编辑效率为10－6（每100万个细胞中有1个细胞具有预期的基因打靶事件）1。1994年，Jasin及其同事们发现，如果使DNA双链在靶基因中发生断裂，并且在断裂的同时提供“供体”DNA模板链，则可以使体细胞内的基因打靶效率提高超过1,000倍2-5。优化后，该系统可用于纠正多达5%细胞中的报告基因4（报告基因传递DNA编辑成功信号）。这一发现表明可通过同源重组在突变位点插入新序列，同时还表明可通过称为非同源末端连接（NHEJ）的过程在断裂位点产生新突变6-8。DNA中特定的双链断裂可诱导修复这一研究发现是基因组编辑领域的基本原理（发展时间线见图1）。
图1. 基因组编辑的发展时间线
AAV表示腺相关病毒，CAR表示嵌合抗原受体，Cas9表示成簇的规律间隔的短回文重复序列（CRISPR）相关蛋白，CCR表示趋化因子辅受体，gRNA表示向导RNA，HE表示归巢核酸内切酶，TAL表示转录激活因子样、TALEN表示转录激活因子样效应核酸酶，ZFN表示锌指核酸酶。
这些早期研究的一个局限性是它们使用了特定的归巢核酸内切酶，这种酶可以识别和切割特定的DNA序列（识别位点）。由于识别位点不存在于内源基因中，因此该方法不能应用于人类细胞。该问题的解决方式是通过基因工程改造核酸酶，从而获得可识别内源基因中的靶位点，并在这些位点刺激基因组编辑的核酸酶4,7-10。此类核酸酶中的第一种是锌指核酸酶，该核酸酶将具有特定识别序列的DNA结合蛋白结合到非特异性核酸酶域中11。除锌指核酸酶外，目前还使用多种核酸酶，包括归巢核酸内切酶和转录激活因子样效应核酸酶（图2 7,12。每种核酸酶都在细胞基因组中产生位点特异性的双链断裂，通过NHEJ或同源介导的双链DNA修复（HDR）激活修复。基于非核苷酸的基因组编辑系统13-16还处于早期开发阶段。
图2. 基因组编辑的核酸酶平台
有四个主要的核酸酶平台用于基因组编辑：归巢核酸内切酶-兆核酸酶（图A）、锌指核酸酶（ZFN）（图B）、转录活化因子样效应核酸酶（TALEN）（图C）和Cas9-gRNA核酸酶（图D）。图中根据识别位点长度和核酸酶的作用（即切割DNA链时它是以二聚体还是单体形式起作用）显示各平台的基本结构和关键特征。兆核酸酶、ZFN和TALEN平台均通过蛋白质-DNA结合产生特异性，而Cas9-gRNA平台通过沃森-克里克RNA-DNA碱基配对产生特异性。
CRISPR-Cas9 核酸酶
研究人员从细菌适应性免疫系统开发出了称作CRISPR-Cas9（与Cas9核酸内切酶相关的成簇的规律间隔的短回文重复序列）的核酸酶平台17-20。然而，由于基因组编辑中仅使用细菌系统的两个成分，即Cas9核酸酶和向导RNA（gRNA），因此该方法被更准确地称作Cas9-gRNA系统。在基因组编辑中，gRNA与DNA靶位点结合后，Cas9核酸酶受诱导发生构象变化，之后将DNA切割。
最常用的Cas9酶来自产脓链球菌。gRNA分子可以定制，以优化与特定DNA靶位点的杂交，从而将Cas9-gRNA复合物引导至所需断裂的位点（图2）19,21。不同于其他的基因组编辑核酸酶系统，将Cas9-gRNA“引导”至其靶位点的过程是由沃森-克里克碱基配对（Watson-Crick base-pairing）进行控制，这是一种易于设计的特性。
通过NHEJ进行的DNA编辑
NHEJ是一种双链断裂修复，不需要“修复”模板21,22。而是由断裂DNA的末端接近、加工，然后连接。NHEJ介导的编辑通常用于所有细胞修复自发断裂。它通常准确（准确率≥70%）23,24，但可能产生错误。NHEJ是免疫系统细胞天然用于在免疫球蛋白和T细胞受体（TCR）编码基因中产生遗传多样性的过程。
在将两个末端结合到一起的过程中，NHEJ机制可能在断裂位点产生小的插入或缺失（indel）。可以插入断裂附近的外源性DNA片段，某些类型的基因组编辑利用了这种现象25,26。可以通过基因工程将DNA组件直接整合到断裂处，方法是将DNA片段各末端与断裂处的两侧连接，但采用这种策略的靶向整合频率较低27-29。如果同时产生两处断裂，并且发生在同一条染色体上且位置接近，则会产生高频率的已定义缺失。如果断裂发生在不同的染色体（在原代人造血干细胞和祖细胞[HSPC]内，发生率为0.2%～0.4%；在原代人T细胞内，发生率为2%～4%），则形成易位（可能是致病性的）23,30,31。NHEJ介导的基因组编辑已被用于有治疗应用潜力的各种策略（图3A）。
图3. 通过非同源末端连接（NHEJ）和同源介导的修复进行的基因组编辑
图A显示通过NHEJ进行的基因组编辑。基因组编辑可通过几种方式利用DNA双链断裂修复的NHEJ机制。图中描述的是NHEJ介导的基因组编辑的三种主要方法，以及如何开发各方法用于治疗特定疾病的例子。插入或缺失（indel）指在断裂处非模板创建小的插入或缺失。图B显示通过同源介导的修复进行的基因组编辑。在基因组编辑中，同源重组或单链模板修复可用于创建基因组的核苷酸特异性变化。图中以示意图形式显示了具有单核苷酸精度，用于创建基因组变化的两种方法的不同应用。ALB表示白蛋白编码基因，HSC表示造血干细胞，HIV表示人类免疫缺陷病毒，indel表示插入或缺失，SCIDX1表示X连锁重症联合免疫缺陷。
通过HDR进行的DNA编辑
有两种不同机制的HDR类型7,12,32,33。在HDR中，将供体DNA模板引入细胞内，使细胞能够使用供体DNA作为模板，修复断裂。一个典型的基因靶向供体模板具有同源臂（每个超过400个碱基），它们位于基因变化部位的侧面。在同源重组中，细胞利用其分子重组机制合成与模板互补的新DNA，然后利用新DNA，通过重组修复断裂处。在自然情况下，这种形式的基因组编辑用于减数分裂重组等过程。可以进行各种幅度的编辑，从单核苷酸变化到插入大的多基因组件（图3B）。可以通过各种方式输送供体模板，包括病毒载体和裸DNA分子。
图3B显示用于治疗人类疾病的一些不同的HDR基因组编辑方法。这些方法包括直接逆转导致疾病的基因变异体34-36；将包含特定基因的互补DNA（cDNA）组件插入该基因的内源性基因座内，从而受到其自身天然调节元件的调节37,38；将cDNA组件插入另一不同基因座内，从而根据该基因座基因的调节元件进行表达39；将转基因组件插入“安全港（safe harbor）”内，旨在避免因与病毒载体半随机整合（尤其是与高表达基因的整合）而导致的意外插入突变，并实现转基因较均匀的表达40。
输送的重要性
为了实现高效编辑，必须在不激活毒性细胞反应的情况下，将足量具有良好特异性的高活性核酸酶输送入细胞核内。在癌症细胞系中，通常可以通过向细胞内转染cDNA（编码核酸酶）的方式产生足量的核酸酶表达。然而，在具有完整抗病毒、细胞质DNA感受机制的原代人细胞中，必须以信使RNA（mRNA）分子（细胞随后翻译）或核糖核蛋白复合物（例如Cas9-gRNA）的形式输送核酸酶23,41。电穿孔是离体输送这些分子的一种有效且相对无毒的方法。
输送核酸酶过程中的其他方面也需要考虑。例如，虽然在将核酸酶输送至原代人细胞方面，mRNA优于质粒DNA，但mRNA可诱发抗病毒Ⅰ型干扰素应答42。此外，核酸酶的长期表达或低特异性核酸酶的表达可导致p53通路持续活化，从而触发细胞周期停滞和凋亡43。
可以向细胞输送足量模板DNA，而不激活毒性细胞应答（例如Ⅰ型干扰素应答），从而实现高频率的HDR介导的编辑。重组腺相关病毒载体已经发展到向细胞核输送单链DNA携带物时避免细胞检查，因此能够有效地向细胞输送典型基因靶向供体模板44-47。
一些方法能够增强HDR介导的细胞内编辑，它们利用小分子靶向特定通路，但这种干预的效应较小，并且不一致；在未对效率进行优化的情况下已经实现了最大效应48-51。此外，应该谨慎：其中一些干预措施干扰了细胞的正常修复方式或对双链断裂的反应方式，因此对于每个细胞在细胞周期中自然发生的20～40个双链断裂，上述干预措施可能损害对这些断裂的修复能力。
使细胞成为药物的离体基因组编辑
在所有基因组编辑方法中，发展最成熟的是离体基因组编辑，即在体外对细胞进行基因工程改造，然后将细胞回输到患者体内。实际上，使用病毒载体对细胞进行的离体基因工程改造（标准基因疗法）已产生了用于治疗遗传性免疫缺陷和癌症的市售产品。
在临床试验中，已经对离体NHEJ介导的基因组编辑进行了试验（图1和表1），包括人类免疫缺陷病毒（HIV）感染者的治疗。从这些患者获取T细胞，进行编辑（敲除编码HIV辅受体的CCR5），随后重新输入患者体内。研究发现该方法安全，并且与受HIV感染的T细胞的增加速度降低（尽管降幅小）相关55。此外，目前已利用基因组编辑制造出“通用的”CAR T细胞，方法是同时破坏TCRα和CD52的编码基因，从而使CAR T细胞对阿仑单抗（alemtuzumab，用于耗竭淋巴细胞的药物）有抗性30。目前正在试验将这些CAR T细胞用于治疗耐药性白血病。据报告，在紧急情况下接受治疗的2例患者已在28日内缓解，虽然由于残留TCR阳性细胞而发生了移植物抗宿主病30。
表1. 基因组编辑临床试验，2009—2019*
* 检索ClinicalTrials.gov发现了14项已结束或进行中的锌指核酸酶（ZFN）试验，8项已结束或进行中的转录活化因子样效应核酸酶NCT，以及12项已结束或进行中的Cas9核酸内切酶相关成簇的规律间隔的短回文重复序列（CRISPR-Cas9）NCT。大多数有关ZFN的临床前研究已经发表并经过同行评议，但几乎没有关于CRISPR-Cas9的临床前研究发表或者经过同行评议。ALB表示白蛋白编码基因，CAR表示嵌合抗原受体，gRNA表示向导RNA，HIV表示人类免疫缺陷病毒，HPV表示人乳头瘤病毒，HSPC表示造血干细胞和祖细胞，NY-ESO表示纽约食管鳞状细胞癌，TALEN表示转录活化因子样效应核酸酶。
† BCL11A在红系增强子处编辑，而不是在基因编码区编辑。
‡ 本试验是一项临床前试验。
§ 本试验是一项临床试验。
这些试验采用锌指核酸酶和转录活化因子样效应核酸酶平台（图2）。而今后几年中，使用Cas9-gRNA系统对HSC和T细胞进行离体修改的多项临床试验将在美国和欧洲启动。试验包括采用NHEJ介导的敲除策略，以产生较强效的CAR T细胞，用于治疗癌症58。试验还包括敲除BCL11A的红系特异性增强子，以上调自体红系HSC 59中的γ球蛋白，作为镰状细胞病和β-地中海贫血的潜在疗法。
基于人HDR的基因组编辑策略可能也将于明年进入临床试验。这些策略包括在患者来源的HSC内，直接修正引起镰状细胞病的变异体，以及产生较强效的CAR T细胞34,39。临床前研究预示针对某些疾病（例如慢性肉芽肿病36,46、X连锁重症联合免疫缺陷37、X连锁高IgM综合征38和HIV感染）的离体、自体、基于细胞的基因组编辑疗法效果良好44,60。
离体细胞基因组编辑的总体效率很高。目前在HSC和原代人T细胞中，能够常规产生效率超过80%的NHEJ介导的插入或缺失，效率超过50%的大片段缺失，以及以30%～70%频率，通过HDR发挥作用的改变。
在原位改变细胞的基因组编辑
对于许多疾病，离体编辑细胞无临床获益。例如，尚无将细胞移植到肝脏内或脑内的可靠方法，这是一个明显的障碍。体内编辑（将编辑装置输送到患者体内，从而在自然条件下对细胞进行编辑）是一个可能的解决方案，在临床前模型中已经使用了这种技术（利用NHEJ和HDR介导的方法）。例子包括将包含治疗性蛋白的组件插入白蛋白编码基因的非编码区52；在肝细胞内产生PCSK9的插入或缺失，以降低胆固醇水平61；去除DMD中的致病外显子，将重度进行性假肥大性肌营养不良转换为较轻度的贝克肌营养不良62-64；以及在小鼠代谢疾病模型中修正致病变异体65,66。
研究已证明人免疫系统（适应性和固有）是体内基因工程取得成功的障碍。转基因免疫原性是标准体内基因疗法和基因组编辑策略面临的难题。在基因组编辑中，免疫系统可能还是编辑机制本身面临的障碍。所有主要核酸酶平台均包含外源蛋白。因此，长期表达核酸酶可能诱发适应性免疫应答，这将清除表达核酸酶的细胞，导致治疗无效并产生毒性作用。此外，首剂给药可能导致患者对之后的给药产生免疫力61。Cas9-gRNA系统中使用的Cas9核酸酶来自两种细菌（产脓链球菌和金黄色葡萄球菌）中的一种。由于每种细菌均在人群中有普遍感染，因此大部分成人之前就对Cas9有免疫力67,68。
基因组编辑的安全性
核酸酶介导的基因组编辑会导致双链断裂，这是基因组不稳定性的一个来源，而基因组不稳定性可能导致致癌性突变。因此，有大量工作专注于了解和减少（通过基因工程）脱靶双链断裂。
缩短核酸酶的表达持续时间（例如以核糖核蛋白复合物的形式输送Cas9-gRNA）可能使特异性出现指数式改善23。由于基因组编辑是一个“一击即跑”的过程，不需要核酸酶的持续表达，因此这一策略有效。改变核酸酶的结合和催化活性同样可改善特异性7,12,69-71。然而，改变一个成分之后可能限制改变另一成分时的灵活性。例如，在以核糖核蛋白复合物的形式输送时，一些特异性较高的Cas9变异体的靶向活性欠佳35。在以与gRNA复合物的形式输送时，一种相对较新的Cas9高保真度变异体同时具有较高的在靶活性和较好的特异性72。
评估基因组编辑的安全性时，面临的一个难题是对于这种新型药物，尚无经过验证的临床前检测方法。目前有不同方法（例如生物信息学、细胞捕获和体外检测）可识别哪些位点可能有脱靶插入或缺失，但没有一种方法被确定为最有效，并且每种方法均有其固有偏倚12,69。
虽然能够以一定水平的灵敏度检测出脱靶插入或缺失，但对于基因组编辑的离体或体内应用，尚无数据指导安全水平。基因组内持续发生自发随机断裂，而经基因工程改造，能够改变大量细胞的核酸酶可能会促进在靶断裂和其他部位自发随机断裂之间的易位。现有检测方法的灵敏度不足以检测到这些事件的发生频率，也并非用于测定这些事件的功能性后果。从单个克隆扩增产生一大群细胞的想法不见得可行，因为在这样的细胞群中，可能以有肿瘤抑制基因自发突变的细胞为主，或者以选择在扩增过程中表达的癌基因为主。每个人都有不同的基因组，并且基线时存在数百万个小差异，这使得难以评估核酸酶产生的潜在小变化的后果，因此使特异性评估进一步复杂化。
使用动物模型预测基因工程安全性不是预测临床试验中安全性的有效方法。虽然已将经基因工程改造的细胞移植到免疫缺陷小鼠体内，以确定安全性41，但不能依靠这种方法识别安全或有毒的基因工程策略。只有当动物模型符合时间和成本效益，并且能可靠预测人体临床试验结果时，开发动物模型才会有用。目前的最佳方法是在仔细控制的1期人体临床试验中评估安全性，试验不仅包括用于裁定不良事件的标准指标，而且嵌入分析性研究，以评估与基因组编辑相关的特定毒性效应，包括克隆性和毒性免疫应答的发生。
人体治疗应用
单基因疾病
对于造血系统和免疫系统等器官系统，在疾病（例如镰状细胞病、X连锁重症联合免疫缺陷和X连锁慢性肉芽肿病）中，大量基因标靶实现的高频率基因修正超过了预计治愈疾病的阈值。这些系统将成为未来数年的临床试验课题。理论上，我们可以借助这一平台治愈造血系统和免疫系统的数百种遗传病。虽然也可通过基因组编辑对其他器官系统的单基因疾病进行基因“修复”，但仍存在困难，包括分离、扩增和移植组织特异性干细胞（用于离体治疗），以及将基因组编辑工具输送到患病组织内（用于体内治疗65,66）。
免疫肿瘤学
基因组编辑正在临床试验中用于改进CAR T细胞疗法（在ClinicalTrials.gov注册号为NCT02808442和NCT02746952；见表1）30，还可以有许多其他使用方式。NHEJ介导的编辑可通过敲除TCRA（编码TCRα）来去除T细胞的同种异体反应性，因此也可通过敲除B2M（编码β2-微球蛋白）来去除免疫原性，还可以移除抑制细胞功能的分子或者促进细胞耗竭的分子，从而增加细胞的效力。HDR介导的编辑可确保将基因插入特定基因座内39。
再生医学
基于细胞的疗法有一种未实现的潜在用途，即利用细胞或干细胞替换或修复患病、受损或老化的组织。基因组编辑提供了一种通过基因工程改造细胞的方法，从而增加细胞效力和安全性。将再生医学和基因组编辑相结合的例子包括通过基因工程改造细胞，使其分泌预防神经退行性疾病的保护因子，例子还包括提供安全开关，从而在细胞开始引起伤害时方便地将其去除。
合成生物学
合成生物学涉及通过基因工程改造细胞，使其获得正常情况不具有的功能。目前可以对细胞进行基因编辑，以分泌治疗性蛋白，以及利用细胞影响动物生理。将基因组编辑和合成生物学相结合的例子包括通过基因工程改造细胞，使其分泌促红细胞生成素73或伤口愈合生长因子74。以后有可能通过基因工程改造细胞，使其分裂、迁移、应答、发出信号和分泌，从而对患病组织环境起到治疗作用。
人类基因组编辑——如何应用
2017年，美国国家科学院、工程院和医学科学院召集的国际研究委员会得出结论，通过采用适当的监管措施（目前并非所有的国家都有），在人体非常早期发育研究中，使用人类基因组编辑可能会获得重要且出乎意外的知识，且应该开展此类研究，但不应用于增强性用途（例如使得健康人获得与治疗或预防严重疾病无关的性状）75。不同于之前的评估，委员会得出结论，导致编辑结果传给后代的基因组编辑（可遗传的编辑或生殖系细胞编辑）在某些非常特殊的情况中可能是可以接受的75。对于可遗传的基因组编辑，其可能的使用标准非常严格，目前尚未达到这些标准，并且标准难以满足，应将其解读为功能性暂停。在英国，Nuffield生物伦理委员会发布了一份报告，其结论与国际研究委员会的结论相似，但并不完全相同76。人们普遍认为，对人类基因组编辑的应用持续进行广泛而透明的讨论非常重要。
正如2018年11月在香港举行的第二届人类基因组编辑国际峰会所报告的那样，最近将基因组编辑应用于胚胎（后来有一对双胞胎出生）不符合伦理，违反了国际研究委员会和Nuffield理事会提出的透明度要求和许多其他标准。有关这对双胞胎的报告未发表，结局未经核实。无论如何，即使这对双胞胎的发育过程中未出现不良事件，该研究也是不负责任和不顾后果的，且违反了关于基因组编辑应用于人体胚胎的广泛国际标准。这强调指出我们迫切需要制定国际标准，这些标准要可供引用，并且可阻止未来再次发生这种不合伦理、不负责任的应用。
结论
基因组编辑是一种变革性的产生药物手段，使基因组工程达到了以前无法实现的精确度。然而，它是一种新兴技术，审慎做法是首先将其应用于严重疾病的患者。在早期的1期和2期人体临床试验中，一定要关注在临床前研究中无法探索的细节，这些细节可能有助于我们设计出迭代方法，从而改进基因组编辑中涉及的分子过程。一旦确定该过程安全有效，就可以考虑将其应用于较轻的疾病。
与开发基因编辑疗法相关的一个关键问题是达到广泛可及这一目标。这些疗法的成本最初可能非常高，但成本效益分析（包括患者的终身治疗成本）可能证明使用这些疗法是合理的。然而，通过控制成本使疗法在可及性方面更加公平仍然很重要，而且继续关注其他策略（如通过遗传咨询进行预防）也很重要。
Disclosure forms provided by the author are available with the full text of this article at NEJM.org.
译者：时境迁，职业翻译
校对：侯海燕，NEJM医学前沿
Matthew H. Porteus, M.D., Ph.D.
From the Department of Pediatrics–Stem Cell Transplantation, Stanford University, Stanford, CA. Address reprint requests to Dr. Porteus at the Department of Pediatrics, Lorry Lokey Stem Cell Research Bldg. MC 5462, 265 Campus Dr., Stanford CA 94305, or at mporteus@stanford.edu.
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