Gregory L. Armstrong ...NEJM2019.12.26
摘要
DNA测序技术（“二代测序”）迅速发展，这使人们对人类基因组学在“精准医疗”中的潜力持乐观态度。与此同时，病原体基因组学已经在通过以下方式提供“精准公共卫生”：更有效地调查食源性疾病暴发，更具针对性地控制结核以及更及时更高粒度地监测流感（进而指导疫苗株的选择）。我们在本文中介绍了公共卫生机构如何通过病原体基因组学来提高几乎所有传染病领域的工作成效。鉴于测序和测序相关技术仍在不断发展，这一势头很可能会持续下去。
公共卫生领域正在发生重大变革。二代测序（也称为“高通量测序”）正在重塑传染病监测工作，使我们能够更早地发现并更精确地调查疾病暴发。二代测序有助于我们更有效地确定微生物的特征，并获得有关微生物生态学和传播的新见解。丰富的序列数据为研究和开发新的诊断和治疗方法的提供了原始资料。本文介绍了病原体基因组学正在如何改变美国和全球公共卫生。
使二代测序适用于公共卫生领域
二代测序的时代始于2005年大规模并行焦磷酸测序的商业化，这是自20世纪70年代桑格测序发明以来测序技术的第一次根本性进步1,2。二代测序的效率在最初几年取得迅速提高，测序成本每年下降高达80%1,3。在公共卫生领域，效率的提高和成本的降低都令人兴奋，因为有无数的潜在应用（包括细菌全基因组测序）4，同时也令人畏惧，因为面临许多障碍——实施二代测序需要对测序设备做出投资，而且也需要高性能计算基础设施来传输、存储和分析大量的序列数据。同样重要的是需要整合生物信息学，而生物信息学对于公共卫生而言是一门新的学科。
在全国范围使用二代测序方面，英国公共卫生部门是早期引领者，尤其是在结核病5,6及细菌性食源性疾病监测方面7,8。在美国，疾病控制和预防中心（CDC）采纳二代测序的时间比较晚9，但现在已广泛应用该技术，其原因很大程度上是美国国会于2013年设立，每年投资达到3,000万美元的先进分子检测（Advanced Molecular Detection）项目，该项目旨在通过二代测序和其他创新实验室技术（首先在CDC采用，之后在全国各州和地方公共卫生部门采用）应对传染病的威胁。
病原体基因组学的应用
如今，病原体基因组学已被纳入CDC的几乎所有传染病项目10。二代测序的某些应用（如用于参考检测等特定目的）仅在CDC使用，而其他应用则在推动国内整个监测系统。下面我们举例说明二代测序技术在公共卫生领域的价值（表1）。
表1. 推动公共卫生领域采纳二代测序的该技术特性
细菌性食源性疾病
在20世纪90年代中期，美国食源性疾病计划首次开始将通过脉冲场凝胶电泳进行的标准化分子亚型分型应用于细菌性病原体，作为常规监测的一部分，这彻底改变了我们发现和调查疾病暴发的方式。由此形成的全国性网络“PulseNet”现在包括80多个公共卫生实验室24。在有PulseNet之前，疾病暴发是很难发现和解决的，除非规模很大，或者在地理和时间上非常集中。例如，在PulseNet出现之前的20年间，只有5次（每年0.25次）李斯特菌病暴发得到解决（即确定了细菌的食物源头）25，每次疾病暴发平均有54例患者。在启动PulseNet后的5年期间，我们发现了11次疾病暴发（每年2.2次），每次暴发的病例数为5例（中位数）25。脉冲场凝胶电泳的常规应用对其他食源性细菌（尤其是沙门菌26和产志贺毒素大肠埃希菌）的检测和应对产生了类似的影响11,27,28。
PulseNet如今已经从脉冲场凝胶电泳过渡到全基因组测序12,29。这一工作的合作伙伴包括美国食品药品管理局（创建了GenomeTrakr系统30,31，用于对食物和环境分离株进行全基因组测序）、美国农业部（Department of Agriculture）和美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information）。
全基因组测序比脉冲场凝胶电泳的分辨率要高得多，全基因组测序通常产生300万～600万bp的序列，而凝胶电泳只有10～20个条带，只能反映基因组中小部分的变化。全基因组测序数据在本质上是数字化、标准化的，因而对所选实验室方案的依赖性要低得多。其结果可揭示细菌分离株之间的演化关系，从而更好地了解细菌的传播和病例之间的关联（图1）。全基因组测序还可以预测表型特征，如毒力、血清型和抗生素耐药性11,13-15,17-19。全基因组测序的成本（根据一项未发表的分析，其成本为每个分离株200～250美元，包括耗材、劳动力、设备、维护和管理费用）目前仍高于脉冲场凝胶电泳（根据上述分析，其成本约为100美元），但全基因组测序不再需要传统的表型检测，这样可以部分或全部抵消其所高出的成本。此外，测序技术的进步和实验室自动化可能会进一步降低全基因组测序的成本。
图1. 通过测序检测和调查疾病暴发的例子
监测传染病的一个重要目的是发现疾病暴发，以便调查和干预。如果可以发现流行病学数据的模式（即在发生于相同时间和地点的病例中发现共同的暴露因素），可能有助于我们从散发病例（其数量通常比疾病暴发中的病例多得多）的背景中鉴别出疾病暴发。通过检测分离株具有相同分子“指纹”的病例，分子亚型分型在这一过程中发挥了越来越核心的作用。
在本图中，我们用示意图显示了一种食源性病原体的监测数据，即美国一个地区在2018年报道的肠道沙门菌肠炎血清型（Salmonella enterica serovar Enteritidis）；2018年时，该地区的一些州已经开始对沙门菌分离株进行实时测序，而另外一些州尚未开始。在这三幅图中，每个点代表一例由肠道沙门菌肠炎血清型引起的胃肠炎。灰点代表后来被确定为“散发”（即与疾病暴发无关）的病例，彩色圆点代表最终确定与疾病暴发相关的病例。这些暴发中最大的一次（红点）最初表现为与两个不同州的餐馆相关的两个病例集群。全基因组测序在这两个集群之间发现了关联，并且在他们与该地区以外的数个病例之间发现了关联。
图A随机显示病例（不考虑分子分型）。图B代表了依据脉冲场凝胶电泳结果对病例进行的分组，脉冲场凝胶电泳是美国公共卫生机构自20世纪90年代起一直使用的一种分子亚型分型技术。在本例中，脉冲场凝胶电泳对最大规模（红色）暴发中的病例进行分组时最为成功；然而，分组结果包括了许多与暴发无关的病例，因而使得调查工作复杂化，降低了找出食物源头的可能性。图C表明，全基因组测序的更高分辨率可以更有效地区分红色暴发中的病例。这样调查人员就对定义的病例集群更有信心，从而能够重点关注更有可能在同一次暴发中出现的病例。在此次疾病暴发中，流行病学调查发现带壳蛋可能是疾病源头，之后从所涉及的蛋分离出肠道沙门菌肠炎血清型，而且证明其全基因组序列与暴发病例相匹配，因而迅速确认了这一疾病源头。除了红色的暴发外，本图还显示了另外四次暴发。蓝色病例属于发生于一个州的一次与餐馆相关的疾病暴发，这些病例与鸡肉相关。两例（紫色）与接触活禽有关，他们属于更大规模、涉及多州、多菌株的一次暴发，此次暴发大部分发生在所示区域之外。调查人员将5例淡粉色病例作为疾病暴发进行了调查，但未确定食物源头。15例淡橙色病例发生在尚未实施实时全基因组测序的州；对其分离株进行测序的时间比较晚，当时明显的疾病暴发已经结束。本图利用简化图总结了通过全基因组测序所确定的关系；然而，在实践中，这些数据将被表示为系统发育树，其中包含更多的细节，并且更精确地表明序列之间的关系。
目前尚不知晓向全基因组测序的过渡将如何影响美国对较常见食源性病原体（如沙门菌和产志贺毒素大肠埃希菌）的监测；然而，在李斯特菌监测中取得的早期经验（2014年转为常规全基因组测序）令人鼓舞。在采用全基因组测序的前3年期间（2013年9月至2016年8月），共有18次（每年6次）李斯特菌病暴发得到解决，每次暴发的病例数为4例（中位数）32。在英国，全基因组测序至少从2015年起已被常规用于检测产志贺毒素大肠埃希菌，而检测到的菌群数量增加了1倍33。
结核
自20世纪90年代以来，一些DNA指纹技术已被证明可用于结核分枝杆菌的亚型分型34。如果可以识别出密切相关的菌株，卫生部门调查人员将可以发现与近期疾病传播相关的病例集群，即需要更深入调查且可能需要干预的病例35。利用全基因组测序进行亚型分型可达到比旧技术更高的分辨率，因此推断病例之间的关系时也更有信心。在选择性应用全基因组测序数年之后，美国结核病控制项目的调查人员如今已经扩大了这一程序的规模，可以对全国所有经培养证实的病例的分离株进行测序。在加利福尼亚州，公共卫生工作者已经可以通过全基因组测序否定一半以上最初通过传统基因分型方法确定的疑似暴发，从而节省了时间和资源（Shaw T，加利福尼亚公共卫生部[California Department of Public Health]：个人通信）。英国5、加拿大36,37和荷兰38的结核病项目取得的早期经验也证实，全基因组测序能够通过以下方式支持对疾病暴发的有效调查：更准确地定义疾病暴发5,36,38，解释疾病传播的动力学39，有时提示存在之前未发现的病例或应优先隔离并治疗的“超级传播者”5,36。全基因组测序还可表明复发病例是由复活还是由再感染引起，而这些信息在评估结核病项目的效果时很有用40。
在全世界结核病负担最重的高发病率、低收入和中等收入国家，能够对病例调查进行优先排序可能也有一定作用41。然而，在这些国家中，二代测序的另外一种应用（对直接来自痰样的结核分枝杆菌进行测序）可能会发挥更重要的作用42。对痰涂片阳性样本中的结核分枝杆菌进行的直接测序在研究机构已经实现43-45，但是对于常规的临床和公共卫生应用而言成本太高，也太繁琐。如果这种方法能够变得实用和具有成本效益，它将能够快速推断出药物敏感性，这对于大多数一线药物而言已经相当准确，并将随着数据的增多而不断改善42,46。除了帮助医师应用适当的药物进行及时治疗之外，二代测序将减少所需的常规表型检测，而常规表型检测复杂、缓慢，并且难以在资源有限的实验室环境中实施。
与此同时，一种中间策略已经在高收入国家得到了应用：直接对早期阳性培养物中的细菌进行全基因组测序，这一方法可早于传统检测结果数周提供药物易感性信息43。纽约州卫生部（New York State Department of Health）和英格兰公共卫生部（Public Health England）42的实验室均获得了监管部门批准，对于全基因组测序预测对全部四种一线药物均敏感的分离株（占所有分离株的70%～80%），这些实验室可不进行传统药物敏感性测试42。
另外一个很有前景的策略是扩增子测序，该方法对特定的分枝杆菌基因或标记序列进行靶向聚合酶链反应（PCR）扩增，然后对产生的扩增子进行测序47。为了确保随着时间的推移，结果仍有意义，基于序列的药物易感性推断方法必须应用相关的基因型和表型数据不断更新数据库42。
流感
季节性流感疫苗候选毒株的选择是一项复杂的全球性工作，涉及几十个国家和相关组织的大规模监测工作。世界卫生组织（WHO）每年2次召集国际专家评估关于流感毒株的信息，并根据这些信息建议北半球和南半球流感疫苗的成分48。CDC每年监督对4,000～10,000个流感样本所做的鉴定，为上述工作做出贡献49。
传统的流感毒株鉴定方法是首先进行病毒培养，而某些毒株（尤其是H3N2）的培养已经变得越来越困难50。培养过程通常需要2次或2次以上的传代，而病毒可能在此过程中发生一些适应性变化。接下来选出一些病毒分离物进行表型分型，表型分型过去包括抗原特征鉴定和特定基因的共有序列（桑格）测序。这些步骤费时又费力。
如今，二代测序使我们可以采用更高效的“首先测序”方法，即直接对原始标本进行全基因组反转录酶PCR，然后测序50-52。这些序列数据使我们能够详细了解病毒出现情况，并且能够选择更少的病毒进行表型特征鉴定（包括抗原分析和对抗病毒药的敏感性）。这种方法不仅速度更快，而且信息量更大。例如，所有病毒节段的详细系统发育信息更详细地说明了流感病毒如何变得多样化，从而规避现有的免疫机制，并且深度测序（对相同样本的许多基因组拷贝进行测序）可以揭示耐药的小变异体，而这些是共有序列反映不出来的。测序不能完全取代传统的表型分型，但对临床标本进行的直接测序使我们能够以更高的选择性进行表型分型。
如今，流感的二代测序数据在每年2次的WHO协商中接受常规评估，而且对这些数据的评估已经至少在两个重要时刻影响了疫苗决策，最近的一次是改变了A（H3N2）疫苗成分，使其可针对新出现的进化枝50,53,54。二代测序数据也被用于预测新毒株的相对重要性和评估风险55-57，确定疫苗效力研究中使用的病毒的特征58，以及指导高流行风险病毒（H7N9）感染者的治疗59,60。
寄生虫病
许多寄生虫病的诊断仍然依赖显微镜技术，这是19世纪的一项技术，依赖于操作者，难以自动化。目前已经针对许多常见寄生虫开发了PCR和其他诊断技术（如血清学），但是需要对每种可疑的病原体进行单独检测。
美国CDC的寄生虫病实验室正在开发新型诊断检测方法，该方法是基于对真核生物管家基因的靶向扩增和二代测序。该方法通过单次检测即可准确检出血液样本中所有已知的潜在人类寄生虫。早期的验证数据提示，这一新的检测方法对血液内寄生虫的敏感性至少与标准PCR同样高61。进一步的验证和开发工作正在进行中，研究人员计划添加更多的靶点，并使该方法适用于组织和粪便等更复杂的样本。
对特定基因的PCR扩增和二代测序是鉴定疟原虫耐药性的有效手段62。因为该检测需要2～3日，而且仍然有些昂贵，因此它在患者常规治疗中的应用仍然有限。然而，对于国家或地区一级的监测而异，这是一种成本效益高且效率高的耐药性评估方法，并且可以更精确地确定治疗建议。基于二代测序的方案还可测定疟疾流行地区居民的感染多样性，从而评估传播强度63。
在美国，圆孢子虫（cyclospora cayetanensis）每年都会引起食源性腹泻的暴发。圆孢子虫的基因型变异性有限，且无法在实验室中繁殖，因而妨碍我们开发用于监测疾病暴发的有效的基因分型方法。CDC开发出了直接从粪便中提取圆孢子虫的方法，并将提取物用于产生多个分离株的全基因组64。几个有前景的基因分型靶点已经确定，这些靶点有望转化成实用且具有鉴别能力的基因分型工具65。
其他应用
二代测序适用于公共卫生领域的各种重要病原体。例如，对于军团病而言，更精细的分型已被用于调查和应对疾病暴发66,67。最后，我们可通过二代测序了解水系统内军团菌的生态学和持久性，从而提高预防能力68。对于医院获得性感染，二代测序已被证明是发现和调查疾病暴发的宝贵工具69,70，并增进了我们对医院70和社区69,71疾病传播的了解。
对于人类免疫缺陷病毒，我们可以分析为了临床目的而产生的基因序列数据，从而确定潜在的病例集群，早期实施干预72,73。如今，易用的工具74已经使州和地方卫生部门能够利用这些数据。在社区水平对丙型肝炎病例集群进行的分子监测也被证明是有用的75。二代测序在公共卫生领域的其他应用包括追踪新出现的抗生素耐药性和新的耐药病原体（如白色念珠菌）71,76，追踪蚊虫病媒对杀虫剂的耐药性77,78，监测链球菌病原体20,79，调查潜在的脑膜炎病例集群80。
测序技术帮助我们应对疾病暴发
二代测序在公共卫生领域的一个重要应用是应对疾病暴发81。例如，就细菌性食源性疾病而言，测序如今已经在发现疾病暴发、调查病例、确认致病食品和追踪源头方面居核心地位。与测序技术的常见用途非常不同的一个例子是来自2014—2016年几内亚埃博拉病毒病暴发的后期，测序技术在这一期间确定了“离群”病例（即与其他病例无已知联系的病例）可能的感染源。每个离群者都引出了令人不安的问题：该病例是否代表了又一个从动物宿主感染的疾病？是通过性传播感染的吗？我们是否漏过了一个很长的传播链？如果是的话将意味着监测工作有严重缺口。上述每个问题都需要不同的应对措施。幸运的是，在此次疾病暴发中，离群者的序列始终与已知暴发区的序列密切相关，而应对小组能够继续集中精力阻止该处的传播10,82。
相反，美洲出现寨卡病毒时对其进行的测序并未能帮助我们针对个体病例采取应对措施。然而，序列数据对于以下几方面至关重要：开发诊断方法和疫苗、增进对流行病发展情况的了解83和近期在古巴未被发现的疾病暴发中提供支持证据84。西非暴发埃博拉病毒病后进行的病毒基因组分析也使我们更加了解病毒的传播85。
未来展望
先进分子检测（Advanced Molecular Detection）项目已经开展了6年，二代测序如今在监测、控制和预防传染病的美国公共卫生项目中居核心地位。目前有几个领域需要取得进展。
宏基因组学
测序（尤其是细菌全基因组测序）通常需要对生物体进行纯培养，随着临床实验室越来越多地使用基于综合征而不依赖培养的高度多重诊断性检查，纯培养越来越难以获得86,87。最为迫切的是随着临床实验室不再使用培养物，这一趋势正对肠道疾病监测产生不利影响88。一种解决方案可能是绕过培养，直接对标本中的病原体基因组进行测序43,89。虽然该方法对特定样本中的特定病原体已经可行，但在常规应用中尚不切实际。
数据整合与数据科学
在公共卫生领域，实验室和流行病学数据通常分开存储和管理。这些数据不久之前还可以汇总起来进行分析，同时不丢失信息：方法是将实验室数据（例如，阳性或阴性结果、滴度或脉冲场凝胶电泳模式标识符）导入流行病学数据库，并使用传统的统计学工具进行分析。但病原体基因组数据却并非如此：我们需要整合实验室和流行病学数据才能实现两者的全部价值36,90,91。
幸运的是，学术研究人员正在解决这一难题92，他们开发出了工具，例如Microreact（https://microreact.org）93、Nextstrain（https://nextstrain.org）94和Interactive Treeof Life（https://itol.embl.de），用于同时显现和分析流行病学和系统发生数据95。更广泛而言，新兴的数据科学领域为整合、分析和显现日益多样化的公共卫生数据提供了新方法31,96。
推进二代测序工作流程的软件
我们需要复杂的工作流程来管理测序过程、分析原始序列数据、存储处理后的数据并将其与流行病学数据整合，以及安全地共享信息。在单个学术实验室中，一位生物信息学家即可做到这一点，但是在公共卫生实验室网络中，集中管理其中的大部分工作可能更为实际。现有生物信息学工具已经可以完成将原始序列数据组装到基因组内的基本步骤，而且现有“管道”已经可以利用这些工具将核心过程（如验证质量、组装基因组和推断表型）自动化。但是通常仍缺少管理工作流程和整合数据的易用工具。而其他情况则有太多的工具，我们尚不清楚哪些工具可以经受住时间的考验。
挑战
微生物学家和流行病学家的人才转型虽然可能是最明显的障碍，但在某种程度上而言却是最易解决的问题，因为他们对基因组学充满热情。即使在招募和保留生物信息学家方面也没有最初预想的那么困难。虽然身处竞争激烈的市场中，但在公共卫生实验室学会-CDC生物信息学专科培训项目（Association of Public Health Laboratories-CDC Bioinformatics Fellowship）最初招募的27名工作人员中，有19人（70%）仍在公共卫生领域工作。留在公共卫生部门的人通常会把握这一机会，成为对社会产生积极影响的重要推动者。
成本是一个更加难以解决的问题。目前，测序的成本通常高于传统的亚型分型。此外，为了降低每个样本的检测成本，MiSeq平台（Illumina）等测序技术可能需要每批检测15个或更多样本，这样可能导致返回结果所需的时间超过测序本身所需的36小时。在快速发展的疾病暴发期间，我们显然不希望有这样的延迟。由于其便携性，单分子大片段测序技术（最著名的是MinION[Oxford Nanopore Technologies]）已经在公共卫生领域找到一定用武之地，而且该技术有可能每批检测的样本数量和返回结果所需的时间82。
数据开放性
在学术界和公共卫生领域，病原体基因组学正开启数据开放的新时代。在美国，地方、州和联邦机构正在将细菌性食源性病原体31、流感50和其他病原体数据上传到国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information）负责的公共数据库中（www.ncbi.nlm.nih.gov/pathogens），使这些数据几乎实现了实时发布。这些机构还为其他全球性数据库做出了贡献，如关系TB测序知识库（Relational TB Sequencing Knowledgebase，ReSeqTB）数据平台（www.reseqtb.org）和全球共享所有流感数据创议（Global Initiative on Sharing All Influenza Data，GISAID；www.gisaid.org），这些数据库旨在促进序列和其他数据的国际交换。除了使数据能够二次使用之外，数据开放还鼓励公共卫生组织、学术界和工业界之间的合作。然而，我们不可能实现数据的无条件完全开放：公共卫生机构一直是数据保密方面的谨慎守护者，病原体基因组数据只有在仔细考虑风险之后才能公布91,97,98。
结论
二代测序和生物信息学正在改变我们对传染病暴发的应对方式，增进我们对疾病发生和传播的了解，加速对病原体的特征鉴定，并促进数据共享（图2）。在公共卫生领域，测序已成为许多核心领域的常规工作，包括食源性细菌病原体、结核病、流感和抗生素耐药性。我们取得这些进展的背景是技术领域的不断发展：二代测序的自动化程度、效率和准确度不断提高，并且相关技术（如用于高度多重DNA扩增的系统）也在不断发展。
图2. 典型的病原体基因组学工作流程
图中显示的是典型的病原体基因组学工作流程。疾病监测工作收集病原体，工作人员从中提取基因组DNA或RNA，切成较短的片段，进行标记，然后进行二代（高通量）测序。将来自测序仪的原始数据分类，重新组装，并与其他基因组进行比对，以便做出比较。组装的基因组可用于多种目的，包括确定相关性和预测表型性状，如毒力、抗生素耐药性和血清型。这些数据正越来越多地实时开放，供研究人员使用，以及用于诊断和治疗方法以及疫苗的开发。
公共卫生领域工作队伍的发展是取得这一进展的核心因素。微生物学家需要强大的微生物基因组学知识基础。流行病学家需要将基因组数据转化为公共卫生举措的技能和工具。微生物学家和流行病学家都需要掌握生物信息学的基本词汇。公共卫生领域应努力吸引具有数据科学技能的专业人员。对于考虑从事公共卫生事业的人而言，现在是激动人心的投身时机。
Disclosure forms provided by the authors are available with the full text of this article at NEJM.org.
The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the views of the Centers for Disease Control and Prevention (CDC) or the Agency for Toxic Substances and Disease Registry. Use of trade names and commercial sources is for identification only and does not imply endorsement by the Office of Advanced Molecular Detection, National Center for Emerging and Zoonotic Diseases, the CDC, the Public Health Service, or the Department of Health and Human Services.
译者：时境迁，职业翻译
校对：侯海燕，NEJM医学前沿
Gregory L. Armstrong, M.D., Duncan R. MacCannell, Ph.D., Jill Taylor, Ph.D., Heather A. Carleton, M.P.H., Ph.D., Elizabeth B. Neuhaus, Ph.D., Richard S. Bradbury, Ph.D., James E. Posey, Ph.D., and Marta Gwinn, M.D., M.P.H.
From the National Center for Emerging and Zoonotic Infectious Diseases (G.L.A., D.R.M., H.A.C.), the National Center for Immunization and Respiratory Diseases (E.B.N.), the Center for Global Health (R.S.B.), and the National Center for HIV/AIDS, Viral Hepatitis, STD, and TB Prevention (J.E.P.), Centers for Disease Control and Prevention, and CFOL International (M.G.) — all in Atlanta; and the Wadsworth Center, New York State Department of Health, Albany (J.T.). Address reprint requests to Dr. Armstrong at the Centers for Disease Control and Prevention, 1600 Clifton Rd., NE, Atlanta, GA 30329, or at garmstrong@cdc.gov.
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