16SrRNAPCR

一、引言
传统的细菌分类以分离培养为前提,然后再依据其形态学、生理生化反应特征、代谢类型以及免疫学特征加以鉴定。20世纪60年代末Woese开始采用寡核苷酸编目法对生物进行分类,他通过比较各类生物细胞的核糖体RNA(rRNA)特征序列,发现16 SrRNA及其类似的rRNA基因序列作为生物系统发育指标最为合适。因为它们普遍存在于原核生物中;其功能比较重要,同源且最为古老;既含保守序列又含可变序列;分子大小适合操作;序列变化可反映进化距离rRNA基因存在于所有原核生物的染色体基因中,在进化过程中高度保守。16SrRNA基因能够满足序列比对要求, GenBank中已有成千上万个16SrRNA基因,利用这些资源鉴定微生物是感染诊断的一个途径。
釆用16 SrRNA基因克隆文库的方法分析菌群组成已广泛应用于环境和临床微生物中既可以分析标本中细菌的种类,又可以反映标本中各种细菌的相对比例,可以相对定量。最重要的是可通过这种方式检测到实验室条件下不能培养的细菌,所以在微生物检测方面具有独特的优势
二、原理
细菌的核糖体RNA(rRNA)按沉降系数分为5S、16S和23S,其编码基因(rDNA)长度依次为120个、1540个及3300个核苷酸。典型的原核生物大肠杆菌核糖体是由50S大亚基和30S小亚基组成的。在完整的核糖体中,RNA约占2/3,蛋白质约为1/3。50S大亚基含有34种不同的蛋白质和两种RNA分子,相对分子质量大的rRNA的沉降系数为23S,相对分子质量小的rRNA为5S。30S小亚基含有21种蛋白质和一个16S的rRNA分子。rRNA基因由保守区和可变区组成,在细菌中高度保守。rRNA基因包含5′端到3'端的若干种成分,分别是16RdNA间区、23 S rDNA、间区和5 S rDNA16 S rDNA基因是细菌染色体上编码16SrRNA相对应的DNA序列,它集保守性和变异性于一身,存在于所有细菌的染色体基因组中16 SrDNA具有以下特点:多拷贝,这就使得针对该编码基因进行的分子生物学检测具有较高的灵敏度;多信息,编码基因由可变区和保守区组成,保守区为所有细菌所共有,细菌之间无差别,可据此设计通用引物(univeralprimer,UP),可变区具有属或种的特异性,可据此进行细菌鉴定;长度适中,其编码基因长度约为1500bp,包含大约50个功能域,既能反映不同菌属之间的差异,又能利用测序技术较容易得到其序列
16SeDNA的以上特征使其成为一种分子标记而广泛地应用于检测和鉴定中。
三、材料及设备
临床标本DNA/RNA提取试剂盒,细菌基因组提取试剂盒,普通PCR试剂盒,荧光定量PCR试剂盒,反转录PCR试剂盒,PCR产物回收试剂盒,DNA测序仪等。
四、方法
获得目的16 SrDNA有两种方法(见图126)。

 

 

1.从基因组直接扩增法
(1)从微生物样品中直接提取总DNA对已知的纯培养的微生物可通过培养富集后再进行提取
细菌培养:将细菌接种于5ml液体培养基中,37摇床(300r/min)培养过夜。
细菌收集:取1ml培养物于1.5mEP管中,室温8000r/min离心5min,弃上清,沉淀重新悬浮于1mlTE(pH8.0)中(用ddH2O也行)。
菌体裂解:加入6l50mg/ml的溶菌酶,37作用2h。再加2mol/LNaCl50l、10%SDs110l、20mg/m的蛋白酶K3,50作用3h或37过夜。(此时菌液应为透明黏稠液体)
抽提:菌液均分到两个1.5mlEP管,加等体积的酚-氯仿异戊醇(25:24:1),混匀,室温放置5~1omin。120o0r/min离心10min。抽提两次。(上清很黏稠,吸取时应小心,最好枪头尖应剪去)
沉淀:加0.6倍体积的异丙醇,混匀,室温放置10min。12000r/min离心10min
洗涤:沉淀用75%的乙醇洗涤。
抽(凉)干后,溶于50ldH2O中,取2~5l电泳。作PCR模板用此外也可使用市售细菌基因组DNA提取试剂盒获得较纯的基因组DNA
2)从医学标本或样品中提取基因组DNA如果提供的材料是医学标本或样品则直接提取基因组DNA而不要培养,此方法如下
液体标本高速离心(12000/min)1omin,沉淀加50l“标本预处理液”,37孵育30min1200o/min离心1omin,沉淀待用;组织标本直接加等量“标本预处理液”,操作同上述。处理后的标本加入30专用裂解试剂(可购自北京美莱博医学技术有限公司),振荡仪上振荡5min,使标本与试剂充分混合,然后煮沸10min,使标本中的核酸物质彻底释放并溶解在缓冲液中;离心后上清即可进行PCR。
(3)PCR扩增rDNA对已知的纯培养的微生物可以设计特异引物,在GenBank搜索同种的菌种的rDNA序列,一般同种的rDNA序列有99%以上的一致性。设计好的引物通过BLAST比对验证其特异性
对医学标本或样品则可设计通用引物扩增目的16S rDNA。如:
正向引物5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAC3
反向引物5′GGTTACCTTGTTACGACTT3′
(4)纯化凝胶电泳检测后可使用PCR产物纯化试剂盒纯化扩增DNA。
2.rRNA反转录法
另一种选择是提取微生物细胞中的核糖体RNA。一个典型的细菌含有100002000个核糖体,rRNA在细胞中的含量很高,易于获得较多的模板,但是RNA易于降解,RNA的提取技术相对于DNA的提取较为复杂,由于rRNA在死亡的细胞中很快降解,提取rRNA通过反转录提取16SrNA序列的方法能够区分被检测的细胞是否为活体细胞。
对未知序列的rRNA要测序,应该对目的rRNA进行纯化,然后以同源已知的rRNA序列为模板设计引物,RT-PCR获得 CdNA再测序
cDNA的合成。反转录体系共20μ,包括细胞总RNA2pg/2pl,50U/ul Rnasin lul.5×反转录反应缓冲液4l,10mmol/ L dNTPs2l,50g/ml随机引物2l,200U/ IM-MLV反转录酶1μl,DEPC8l。37反应60min,955min终止反应。cDNA在-80保存或进行PCR扩增
如果实验对象是纯培养物,则可以按上述方法获得rDNA后直接测序。对于从样品标本中获得的rDNA,需构建16SrNA文库,然后挑取单克隆测序。
3.PCR方法
通常做20l反应体系,加人10×缓冲液2μl,模板量为100~100000个拷贝,引物浓度为0.2~1umol//L, d NTPs浓度为20~200gmo/L,镁离子浓度应比dNTPs浓度高0.2~2.5mmol/L,Taq酶量为0.2~0.5U,补水至20l。
反应条件为:95预热5min,94变性30s,退火30s[温度根据引物(G+C)含量确定],72延伸1~2min(根据酶活性和扩增片段长度确定),30个循环后再延伸10min
五、注意事项
采用PCR技术可以一次性从混合DNA或RNA样品中扩增出16SrRNA序列,但也同样会出现PCR所固有的缺点,尤其是采用16 SrRNA保守序列的通用引物对多种微生物混合样品进行扩增,可能出现嵌合产物( chimericproduct)和扩增偏嗜性现象。
采用16 SrRNA基因克隆文库的方法分析菌群组成,既可以分析标本中细菌的种类,又可以反映标本中各种细菌的相对比例,可以相对定量。但不是绝对定量,即标本中菌群的比例与克隆文库中对应单克隆的比例相关,但不是直线相关。
另外,16 SrDNA基因克隆文库不能完全反映标本的真实情况,有些细菌的比例太低,或有的细菌的rDNA不能用通用引物扩增出来而无法在克隆文库中出现。前者可通过加大文库量来解决,后者可通过设计兼并引物和多对引物同时使用部分解决
六、应用
下面以肉毒梭菌为例介绍16SrRNA的应用。
肉毒梭菌广泛存在于自然界,引起中毒的食品有腊肠、火腿、鱼及鱼制品和罐头食品等。
肉毒梭菌为专性厌氧的革兰阳性杆菌,其芽胞呈卵圆形、位于近端位,在庖肉培养基中生长时,混浊、产气、发臭、能消化肉渣
肉毒梭菌按其所产毒素的抗原特异性分为A、B、C、D、E、F、G七个型
肉毒梭菌16 SrRNA可应用于肉毒梭菌的检测、鉴定、监测及系统进化研究。
1.检测
能引起中毒的食品有腊肠、火腿、鱼及鱼制品和罐头食品,对肉毒梭菌和肉毒毒素的检出非常重要。目前以毒素的检测及定型试验为判定的主要依据,但只以毒素为依据还不能排除有芽胞存在的可能。若食品中混入芽胞,则只检测毒素不能确保食品安全,还需检测肉毒校菌细胞的存在
使用前述方法,从样品中提取总DNA,然后设计通用引物扩增出16s5DNA,构建rDNA文库测定不同16S rDNA序列并与 GeneBank数据库比对,确定有无肉毒梭菌16 S rDNA的存在或者以肉毒梭菌16 STDNA为探针,与样品中扩增出来的16mNA杂交,根据杂交信号判断
16 SrDNA鉴定法具有传统方法无法达到的高灵敏度和特异性,检测能力大大增强,所需检测时间大大缩短。并且该法不依赖于微生物的分离培养,是一种非培养分析技术,所以不仅能鉴定出死菌而且还能够快速地鏊定出那些目前尚不能人工培养的微生物,如粪便中的共生菌群鉴定指标单一明确,准确率高,而传统技术必须综合大量的指标加以鉴定
3.定量监测
荧光定量PCR技术利用Tag酶切酶核酸活性,在普通引物5端和3端添加一条荧光双标记探针,分别标记荧光报基团(Q,当探针保持完整时,R基团的荧光信号被Q基团抑制,一且探抑制作用消失,R基团的荧光信号就可以被检测到。该方法完全在密团条件下CR产物的交叉污染,结果判断由计算机完成,步骤简单而且结果可靠
通过荧光定量PCR技术可测定样品中16 SrDNA的相对含量,从而推测出肉毒梭菌的在样品中的含量,为食品安全检查等工作提供重要信息
4.系统进化研究
16 SrDNA比整个细菌基因组进化得要缓慢,因而具有高度的保守性,普遍存在于原核生物中,并且大小适中、易于克隆,在系统进化研究中有重要应用。
目前已有大量研究以165DNA为依据研究不同物种之间的进化关系。应用生物信息学软件如Megalign通过16srNA之间的比对,做出系统进化树( phylogenetictree》,可以清楚地分析种间进化距离
笔者通过这种方法构建出若干不同型号的肉毒梭菌的进化树(见图127)
图128是根据16SEDNA对梭菌属进行分类作出的进化树
型分类法将肉毒梭菌分为4组。组1:A型和水解蛋白的(proteolytic)B型和F型;组2:E型和不水解蛋白的(non-proteolytic)B型和F型;组3:C型和D型;组4:G型。以165TDNA的方法构建出进化树的结果与表型分类法结果相符
传统的微生物鉴定方法以细胞的表型为基础,包括细胞形态、培养特征、生理生化试验、代谢类型和免疫分型等。这些表型特征比较复杂多变,而且有些指标不稳定,易受环境影响。而6SrDNA普遍存在于真核细胞内,性质稳定、检测方便、判断方法简单。以16sDNA为依据医学微生物和环境微生物等检验鉴定方法已普遍推广,并取得显著成效