1. 六孔板每孔细胞中加入1ml Trizol,冰上放置5min,枪头吹打。
2. 将各孔裂解液吸到1.5 ml EP管中,加入氯仿0.2ml/管,用力振摇15s。15-30℃下孵育2-3min,离心(4℃,12,000g,15min)。
3. 离心后液体分为三层(上层-无色水样层为RNA,中层白色为DNA和底层红色为蛋白质),小心吸取上层无色液体移入一新的EP管中。
4. 加入等体积异丙醇,0.4-0.5ml,混匀,15-30℃下孵育10-30min,离心(4℃,12,000g,10min)。其中如果加入等体积异丙醇后,置于试管架上用PE手套密封后,放于4℃冰箱中,沉淀30min效果更好。
5. 去上清,沉淀加入75%乙醇1ml,漩涡振荡30s,离心(4℃,7,500g,5min)。
6. 小心去上清,管内沉淀在超净台中鼓风静置干燥3-5min。最好是用枪头吸取上清,尽量除去。
7. 加入20ul DEPC水溶解,分装5ul/管,-70℃冰箱保存。
8. 细胞总RNA的鉴定:0.9-1.2%琼脂糖电泳鉴定细胞总RNA,观察出现条带及各条带亮度。紫外分光光度计测定:分别测定细胞总RNA在260nm和280nm处的光密度值(OD),并计算RNA的含量和纯度。
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