李静雯，李秋桐，母应春，苏 伟*
（贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550025）
摘 要：以山羊肉为原料，添加乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici，PA）和米根霉（Rhizopus oryzae，RO）进行混合发酵，制作羊肉发酵香肠。结合pH值、色差和感官评价结果探究菌种的复配比例、接种量、发酵温度和发酵时间对羊肉发酵香肠的影响，在单因素试验的基础上，以感官评分为响应值，选取菌种复配比例、接种量和发酵温度进行三因素三水平的Box-Behnken design（BBD）响应面优化试验设计，确定制作羊肉发酵香肠的最佳工艺参数。结果表明：在发酵时间为16 h的条件下，PA与RO复配发酵羊肉香肠的最佳工艺参数为复配比例1∶1、接种量2.2%、发酵温度32 ℃。在此条件下羊肉发酵香肠的感官评分为6.34分，与模型理论值相接近。最佳工艺条件下，PA与RO复配发酵羊肉香肠的pH值在5.2～5.3之间，酸度适中，且色差值与空白组无显著差异，感官品质提高，膻味降低。
关键词：乳酸片球菌；米根霉；Box-Behnken响应面优化试验；羊肉发酵香肠
羊肉不仅味道鲜美、营养丰富，还含有人体所需的必需氨基酸，但生羊肉具有让人难以接受的膻味[1-3]。羊肉的膻味主要来自脂肪中的支链脂肪酸[4-7]，目前，国内外研究人员主要利用植物乳杆菌[8-11]、弯曲乳杆菌[12]、产香戊糖片球菌[12-13]、葡萄球菌[13]、清球乳杆菌[12,14]、木瓜蛋白酶[8]以及嗜酸乳杆菌[15]等对羊肉进行发酵除膻。乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici，PA）具有较好的耐盐性，产酸速度快，且抑菌能力较强[16-17]，现已从发酵香肠[18]、发酵肉[19]、啤酒[20]和米酒[21]等食品中分离出乳酸片球菌，并将其用于猪肉[22-23]和鸭肉香肠[24]的制备，获得了感官品质较好的产品。乳酸菌可以通过糖酵解途径进行发酵，使肉制品的pH值及水分活度（water activity，aw）降低，产生刺激性气味，引起肉中蛋白质的降解和凝固，对氨基酸的产生有重要作用，从而影响产品的整体风味。
发酵香肠的风味形成与霉菌和酵母菌的蛋白质、脂肪分解以及乳酸降解有关。大多数根霉脂肪酶具有Sn-1（3）位置特异性，将适量具有这一特性的脂肪酶加入香肠中可以显著增加香肠的香气，同时加速脂肪的氧化及水解[25-26]。脂肪酶大多以胞内酶为主，当pH值下降至5时可以促进根霉产胞外脂肪酶。本研究以山羊肉为原料，添加乳酸片球菌和米根霉（Rhizopus oryzae，RO）[27-29]进行混合发酵，制作羊肉发酵香肠，结合pH值、色差和感官评价结果探究菌种的复配比例、接种量、发酵温度和发酵时间对羊肉发酵香肠的影响，在此基础上利用响应面优化试验进一步分析，得到加工低膻羊肉发酵香肠的最佳工艺参数。
1.1 材料与试剂
羊瘦肉、羊肥膘 贵州省晴隆县海权清真肉羊食品加工有限责任公司；食盐、蔗糖、白酒、肠衣 贵州省贵阳市合力超市；CICC 10344乳酸片球菌 中国工业微生物菌种保藏管理中心；ATCC 96382米根霉 广东省微生物菌种保藏管理中心；其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
Testo205便携式pH计 德图仪表（深圳）有限公司；SC20色差仪 苏州欣美和仪器有限公司；FA2004N电子天平 上海菁海仪器有限公司；TGL20M台式高速冷冻离心机 长沙迈佳森仪器设备有限公司；DHP-420电热恒温培养箱 天津天泰仪器有限公司；YXQ-LS-100SII立式压力蒸汽灭菌器 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；SW-CJ-IFD超净工作台 苏州苏洁净化设备有限公司。
1.3 方法
1.3.1 羊肉发酵香肠配方及制作工艺
配方：羊瘦肉与羊肥膘质量比为8∶2，辅料为食盐2.0%、蔗糖0.7%、白酒1.5%和冰水15%（均为在羊肉中的质量分数）。
制作工艺：原料→漂洗→瘦肉绞碎、肥肉切丁→加入辅料以及占辅料中冰水50%的冰水，腌制24 h→添加发酵剂→斩拌均匀→灌肠→恒温发酵→干燥（20 ℃，2 d）→蒸制（85 ℃，1 h）
1.3.2 菌种培养
按照说明书中的步骤将PA活化2 代，接种于PA种子培养基中，37 ℃培养24 h；从种子培养基中取2%菌液加入PA扩大培养基中，37 ℃培养24 h；6 000 r/min条件下离心10 min，弃去上清液，用生理盐水清洗沉淀3 次，加入无菌水，调整活菌数至108 CFU/mL，备用。
按照说明书中的步骤将RO活化2 代，转接至斜面培养基中，30 ℃培养3～5 d；向斜面培养基[30-31]中加入5 mL无菌水并轻轻刮下孢子，重复清洗3 次，合并孢子液于盛有玻璃珠的三角瓶中，反复振荡后用带有灭菌脱脂棉的漏斗过滤，得到孢子液，调整孢子液浓度为108 CFU/mL，备用。
1.3.3 单因素试验设计
以pH值、色差和感官评分为评价指标，探究2 种菌的复配比例（RO∶PA）（m/m）、接种量（菌液在羊肉中的质量分数）、发酵温度和发酵时间对发酵香肠的影响。以不接种菌种的发酵香肠为空白对照组。单因素试验设计中各因素的水平如表1所示。
表 1 单因素试验中各因素水平表
Table 1 Levels of independent variables used for one-factor-at-a-time method
1.3.4 响应面试验设计
结合单因素试验结果，以感官评分为响应值，选取对产品影响较大的3 个因素进行三因素三水平响应面试验设计中心组合试验，确定制作发酵香肠的最佳工艺参数。
1.3.5 pH值及色差测定
利用便携式pH计测定香肠的pH值，利用色差仪测定香肠的亮度值（L*）、红度值（a*）和黄度值（b*）。样品均平行测定3 次。
1.3.6 感官评价
由9 名食品专业的学生组成感官评定小组，采用10 分制对发酵香肠的形态、色泽、膻味和咀嚼性进行评分，并结合权重计算香肠的感官评分，感官评分=形态×10%＋色泽×15%＋膻味×60%＋咀嚼性×15%。香肠的感官评价标准如表2所示。
表 2 感官评分标准
Table 2 Criteria for sensory evaluation of sausage
1.4 数据处理
采用Design-Expert V8.0.6软件进行响应面试验设计与分析，采用SPSS 19.0软件中的新复极差法对数据进行显著性分析。
2.1 单因素试验结果
2.1.1 菌种复配比例对羊肉发酵香肠的影响
图 1 菌种复配比例对羊肉发酵香肠pH值和感官评分的影响
Fig. 1 Effect of PA/RO ratio on pH value and sensory score of fermented mutton sausage
小写字母不同，表示不同组别间差异显著（P＜0.05）；大写字母不同，表示不同组别间差异极显著（P＜0.01）。下同。
由图1可知，菌种复配比例为1∶1时，羊肉发酵香肠的感官评分最高，为（6.67±0.44）分，此时香肠的pH值为5.33±0.08；复配比例为1.25∶1时，香肠的感官评分最低，为（4.89±0.51）分，此时的pH值为5.19±0.05。复配比例为1∶1的香肠，其感官评分显著高于其他4 组香肠（P＜0.05），且与复配比例为0.5∶1、1.25∶1的香肠差异极显著（P＜0.01）。这表明复配比例为1∶1时，菌种的产酸能力适当，香肠pH值降低，促使蛋白质沉淀和降解，使其滋味及膻味得到改善，这与李超等[24]的研究结果类似。
表 3 菌种复配比例对羊肉发酵香肠色差的影响
Table 3 Effect of PA/RO ratio on color difference of fermented mutton sausage
注：同行小写字母不同，表示不同组别间差异显著（P＜0.05）；同行大写字母不同，表示不同组别间差异极显著（P＜0.01）。下同。
由表3可知，空白组羊肉发酵香肠的L*与复配比例为1.25∶1的样品间差异极显著（P＜0.01），但与其他处理组均无显著差异，复配比例为0.75∶1和1.25∶1的样品间差异显著（P＜0.05）；空白组羊肉发酵香肠的a*和b*与其他处理组间均无显著差异。总体而言，复配比例为1∶1的样品色差与空白组接近，具有较好的色泽。
2.1.2 菌种接种量对羊肉发酵香肠的影响
图 2 菌种接种量对羊肉发酵香肠pH值和感官评分的影响
Fig. 2 Effect on inoculum amount on pH value and sensory score of fermented mutton sausage
由图2可知，菌种接种量为2.0%时，羊肉发酵香肠的感官评分最高，为（5.77±0.49）分，此时香肠的pH值为5.26±0.10；菌种接种量为3.0%时，香肠的感官评分最低，为（4.16±0.09）分，此时的pH值为5.16±0.02。接种量为2.0%和2.5%的香肠，其感官评分显著高于其他3组香肠（P＜0.05），且与接种量为3.0%的香肠差异极显著（P＜0.01）。这表明菌种添加量过大时，发酵体系中产生大量的酸导致香肠酸味过重，pH值降低，影响其形态、色泽、膻味及咀嚼性，因此感官评分降低；但菌种添加量较少可能导致发酵不充分，使发酵香肠缺乏固有的酸味且香味和膻味较重，感官品质不佳。
表 4 菌种接种量对羊肉发酵香肠色差的影响
Table 4 Effect on inoculum amount on color difference of fermented mutton sausage
由表4可知，空白组羊肉发酵香肠的L*和a*与其他处理组间均无显著差异；菌种接种量为1.5%的羊肉发酵香肠的b*显著低于空白组（P＜0.05），其他处理组香肠的b*与空白组间均无显著差异。
2.1.3 发酵时间对羊肉发酵香肠的影响
图 3 发酵时间对羊肉发酵香肠pH值和感官评分的影响
Fig. 3 Effect of fermentation time on pH value and sensory score of fermented mutton sausage
由图3可知，羊肉发酵香肠的pH值随发酵时间的延长呈下降趋势，发酵16 h时，香肠的感官评分最高，为（5.89±0.14）分，此时香肠的pH值为5.33±0.01；发酵24 h时，香肠的感官评分最低，为（3.88±0.11）分，此时的pH值为5.16±0.02。发酵8 h时，香肠的pH值较高，为5.83±0.03，接近于空白组（6.03±0.01），但咀嚼性无显著变化，膻味较重；发酵24 h时，香肠的pH值过低，酸味浓郁，咀嚼性明显提高，色泽较差。不同发酵时间香肠间的感官评分差异均不显著（P＞0.05）。综上所述，选择16 h为最适宜的发酵时间。
表 5 发酵时间对羊肉发酵香肠色差的影响
Table 5 Effect of fermentation time on color difference of fermented mutton sausage
由表5可知，空白组羊肉发酵香肠的L*和b*与其他处理组间均无显著差异；发酵24 h时，香肠的a*显著低于空白组和发酵20 h的香肠（P＜0.05），但与其他处理组间均无显著差异。
2.1.4 发酵温度对羊肉发酵香肠的影响
图 4 发酵温度对羊肉发酵香肠pH值和感官评分的影响
Fig. 4 Effect on fermentation temperature on pH value and sensory score of fermented mutton sausage
由图4可知，发酵温度为30 ℃时，香肠的感官评分最高，为（5.91±0.15）分，此时香肠的pH值为5.35±0.02；发酵温度为16 ℃时，香肠的感官评分最低，为（4.38±0.19）分，此时的pH值为5.63±0.01。不同发酵温度下，香肠的pH值呈先下降后上升的趋势，发酵温度为16、44 ℃时，香肠的pH值分别为5.63±0.01和5.72±0.02，接近于空白组（5.98±0.05）。这表明发酵温度过低或过高时菌种的生长均会受到抑制[32]，导致香肠的pH值升高，膻味明显，感官评分降低。发酵温度为30 ℃时，香肠的感官评分最高，且与其他4 组间差异极显著（P＜0.01）。
表 6 发酵温度对羊肉发酵香肠色差的影响
Table 6 Effect of fermentation temperature on color difference of fermented mutton sausage
由表6可知，发酵温度为44 ℃时，香肠的L*显著高于30 ℃时（P＜0.05），但发酵温度为30 ℃或44 ℃时，香肠的L*均与其他处理组间无显著差异；发酵温度为44 ℃时，香肠的a*显著高于16 ℃时（P＜0.05），但发酵温度为16 ℃或44 ℃时，香肠的a*均与其他处理组间无显著差异；空白组香肠的b*显著高于发酵温度为16 ℃时（P＜0.05），但与其他处理组间均无显著差异。表明发酵温度过低时，香肠的色差值偏低。
综上所述，pH值为5.2～5.3时，羊肉发酵香肠的感官评分最高，此时酸度适中，口感在大多数人可接受的范围内，且此条件下有利于RO产胞外脂肪酶促进脂肪分解和氧化，产生特殊风味物质，羊肉的膻味得到显著降低。香肠的整体颜色偏黄少红，这可能是由于蒸制时肌红蛋白损失，导致香肠颜色变浅。由于不同发酵时间香肠间的感官评分差异均不显著（P＞0.05），因此选择菌种复配比例、菌种接种量和发酵温度3 个因素进行响应面优化试验。
2.2 响应面优化试验结果
2.2.1 响应面优化试验结果及方差分析
表 7 响应面因素水平及编码
Table 7 Factors and levels used in response surface design
采用Design-Expert V8.0.6软件对数据进行回归分析，得到以感官评分（Y）为响应值的二次多项式回归方程为：
Y=－22.606 56＋29.669 44A＋1.704 17B＋0.770 10C＋3.333 33AB＋0.130 00AC＋0.025 00BC－20.288 89A2－1.350 00B2－0.015 16C2。
由表7～8可知，各实验组香肠的L*和a*均无显著差异（P＜0.05）；对于b*，第6组与第8组分别显著高于第10、14、15组（P＜0.05），但空白组香肠的b*与各处理组间均无显著差异（P＜0.05），这表明添加菌种后香肠的感官品质并未发生较大改变。
表 8 响应面试验结果
Table 8 Response surface design arrangement with experimental and predicted sensory scores as well as pH value and color paprameters
注：同列小写字母不同，表示差异显著（P＜0.05）。
表 9 响应面试验结果的方差分析
Table 9 Analysis of variance for the regression model
注：*. 差异显著（P＜0.05）；**. 差异极显著（P＜0.01）。
由表9可知，模型显著性检验P＜0.05，表明该模型具有统计学意义。B、AB项差异显著（P＜0.05），C、A2、C2差异极显著（P＜0.01）。失拟项用来表示所用模型与实验拟合的程度，即二者的差异程度，失拟项P=0.087 8＞0.05，说明对模型有利，无失拟因素存在，因此可用该回归方程代替实验真实点对实验结果进行分析。影响羊肉发酵香肠感官评分的因素依次为C（发酵温度）＞B（菌种接种量）＞A（菌种复配比例），其中发酵温度的影响极显著（P＜0.01），菌种接种量影响显著（P＜0.05）。矫正决定系数R2Adj=0.908 9＞0.8，变异系数为1.98%，说明有9.11%的变异能由该模型解释。
2.2.2 各因素间的交互作用分析
图 5 菌种复配比例和菌种接种量对羊肉发酵香肠感官评分交互作用的响应曲面图
Fig. 5 Response surface and contour plots showing the interactive effects of PA/RO ratio and inoculum amount on sensory score
图 6 菌种复配比例和发酵温度对羊肉发酵香肠感官评分交互作用的响应曲面图
Fig. 6 Response surface and contour plots showing the interactive effects of PA/RO ratio and fermentation temperature on sensory score
图 7 菌种接种量和发酵温度对羊肉发酵香肠感官评分交互作用的响应曲面图
Fig. 7 Response surface and contour plots showing the interactive effects of inoculum amount and fermentation temperature on sensory score
由图5～7可知，菌种复配比例与发酵温度、菌种接种量与发酵温度对羊肉发酵香肠感官评分交互作用的响应曲面图中的等高线接近圆形，交互作用不显著，而菌种复配比例与菌种接种量间的交互作用显著。
综上所述，制作发酵羊肉香肠的最佳工艺参数为菌种复配比例（RO∶PA）1.01∶1.00（m/m）、接种量2.17%、发酵温度31.52 ℃、发酵时间16 h，此时香肠的感官评分最高，为6.37 分。
2.2.3 验证实验
考虑到实际操作的可行性，将得到的最佳工艺参数条件调整为复配比例1∶1、接种量2.2%、发酵温度32 ℃、发酵时间16 h进行验证实验，重复3 次。香肠的感官评分平均值为6.34 分，pH值为5.27±0.03，与模型理论值相近，说明该模型能较好地用于优化羊肉发酵香肠的制备工艺。
结合pH值、色差和感官评价结果探究菌种的复配比例、接种量、发酵温度和发酵时间对羊肉发酵香肠的影响，在此基础上利用响应面优化试验进行进一步分析，得到加工低膻羊肉发酵香肠的最佳工艺参数为复配比例1∶1、接种量2.2%、发酵温度32 ℃、发酵时间16 h，此时香肠的最佳感官评分为6.34 分。验证实验表明本研究建立的模型能较好地用于优化羊肉发酵香肠的制备工艺。pH值为5.2～5.3时，羊肉发酵香肠的感官评分较好，此时香肠的酸度值在可接受范围内，不会由于过酸导致其他香味被掩盖，同时能够增加香肠的硬度和咀嚼性。对羊肉发酵香肠的色差分析表明，添加菌种后对羊肉发酵香肠的色泽影响不大，处理组与空白组间差异不显著，香肠具有较好的感官品质。本研究结果表明，采用PA和RO复配发酵时，可以降低香肠膻味，提高香肠风味，本研究确定的制备工艺可行。
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LI Jingwen, LI Qiutong, MU Yingchun, SU Wei*
(School of Liquor and Food Engineering, Guizhou University, Guiyang 550025, China)
Abstract: In this study, we aimed to the optimum processing parameters for fermented mutton sausage made from goat meat using a mixed starter culture of Pediococcus acidilactici (PA) and Rhizopus oryzae (RO). The effect of PA/RO ratio,inoculum size, fermentation temperature and time on the pH value, color and sensory evaluation of sausage was investigated by one-factor-at-a-time method. Subsequently, PA/RO ratio, inoculum size, fermentation temperature were optimized using response surface methodology with a three-factor, three-level Box-Behnken design (BBD). The response variable was sensory score. A fermentation time of 16 h, temperature of 32 ℃, a PA/RO ratio of 1:1 and an inoculum size of 2.2% were found to be the optimum processing conditions to obtain a higher sensory score of 6.34, agreeing with the model predicted value. The sausage prepared using the optimized conditions had moderate acidity (pH 5.2–5.3) and showed no signif i cant difference in color difference as well as improved sensory quality and reduced mutton smell compared with the uninoculated and fermented sausage.
Key words: Pediococcus acidilactici (PA); Rhizopus oryzae (RO); Box-Behnken design (BBD); fermented mutton sausage
DOI:10.7506/rlyj1001-8123-201711004
中图分类号：TS251.5
文献标志码：A
文章编号：1001-8123（2017）11-0020-06引文格式：
李静雯, 李秋桐, 母应春, 等. 响应面法优化羊肉发酵香肠工艺[J]. 肉类研究, 2017, 31(11): 20-25.
DOI:10.7506/rlyj1001-8123-201711004. http://www.rlyj.pub
LI Jingwen, LI Qiutong, MU Yingchun, et al. Process optimization for fermented mutton sausage using response surface analysis[J]. Meat Research, 2017, 31(11): 20-25. DOI:10.7506/rlyj1001-8123-201711004. http://www.rlyj.pub
收稿日期：2017-07-23
基金项目：贵州省科技重大专项计划项目（[2016]3002）
作者简介：李静雯（1993—），女，硕士研究生，研究方向为肉制品质量安全与加工。E-mail：18798081560@163.com
*通信作者：苏伟（1974—），男，教授，博士，研究方向为肉制品质量安全与加工。E-mail：sw1886@163.com
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