社会等级（social hierarchy）是指动物种群中各个动物的地位具有一定顺序的等级现象。等级形成的基础是支配行为，或称支配-从属（dominant-submissive）关系。图片来源：Debt Reduction Services
社会等级是一种自然发生的现象，在人类及多种动物中具有进化保守性[1, 2]。神经生物学研究表明，社会等级的建立依赖于多个脑区，如内侧前额叶皮层（mPFC）、海马、杏仁核、伏隔核等等，其中mPFC尤为重要[1, 3]。近期研究发现，社会等级优势小鼠mPFC的神经元活性升高，而抑制mPFC神经元活性则会导致小鼠社会等级下降[4, 5]。然而，有关mPFC神经元调控社会等级的分子机制，尚未可知。图片来源：onlinemarketinginct.com另有研究显示，自闭症等多种异常社交行为与长非编码RNA (lncRNA)密切相关[6, 7]。那么，lncRNA，尤其是mPFC神经元中的lncRNA，是否参与社会等级的调控呢？2020.01.20日，《Cell Research》杂志在线刊登了华中科技大学同济医学院朱铃强、刘丹课题组的最新重要工作[9]，他们在mPFC中发现一种lncRNA——AtLAS，这种lncRNA可调节突触蛋白IIb的表达水平从而调控AMPA受体的转运过程，进而影响小鼠的社会等级。该研究首次发现AtLAS及突触蛋白IIb对社会等级的调控作用，极大提高了人们在社交行为领域的认知。朱铃强教授
首先，作者通过钻管实验（tube test）筛选出社会等级优势鼠与劣势鼠，再通过微阵列分析手段探究优势鼠和劣势鼠mPFC的lncRNA表达谱差异（图1a）。他们发现优势鼠mPFC中，181种lncRNA表达上调，97种lncRNA表达下调，其中AK013786表达下调水平最高（图1b-c）。基因组定位结果显示，AK013786是突触蛋白II的反义lncRNA，作者将其命名为AtLAS。AtLAS的3’端包含一段poly-A序列，其序列与UCSC基因组数据库序列相一致，主要表达在兴奋性神经元中（图1d-f）。此外，AtLAS表达水平仅在优势鼠的mPFC中显著下调，在嗅球、纹状体、海马等其它脑区表达水平几乎不变（图1g）。图1 社会等级优势鼠mPFC的lncRNA表达谱
2.mPFC锥体神经元中AtLAS双向调控社会等级优势
接下来，为探究AtLAS是否参与社会等级优势的形成，作者使用shRNA介导的基因沉默方法。他们在CamKII-Cre小鼠的mPFC中注射AAV-DIO-sh-AtLAS以下调mPFC锥体神经元中AtLAS的表达。他们发现这些小鼠的社会等级显著上升（图2a-d）。除此之外，他们在优势小鼠的mPFC中注射AAV-CamKII-AtLAS以在锥体神经元中实现AtLAS的过表达。他们发现这些小鼠的社会等级显著下降（图2e-g）。以上结果表明，mPFC锥体神经元AtLAS在社会等级优势的形成过程中具有充分必要性。图2 mPFC锥体神经元中AtLAS双向调控社会等级优势
3. AtLAS调控突触蛋白II不同亚型的表达水平
在知悉AtLAS的功能后，作者就其靶向分子展开进一步探究。AtLAS位于6号染色体的负链，在突触蛋白II的互补链上（图3a），因此它有可能通过顺式作用调控突触蛋白II不同亚型的表达水平[10]。事实上，注射AAV-DIO-sh-AtLAS的CamKII-Cre小鼠mPFC神经元中，突触蛋白IIb（Syn2b）的表达水平显著下调，而突触蛋白IIa（Syn2a）的表达水平显著上调（图3b-c）。另外，作者发现优势鼠AtLAS的缺失主要发生于细胞核而不是细胞质中（图3d），于是他们推测AtLAS可能通过调节突触蛋白II基因的可变多聚腺苷酸化（APA），进而调控突触蛋白IIa/b的比率。他们还发现，Syn2b基因的3’-UTR区域有两个CUGBP, ELAV-like family member 4（CELF4）蛋白结合域（图3e-f）。事实上，CELF4也可以和突触蛋白II基因外显子11和外显子12之间的序列（pre-Syn2）相结合（图3g-h）。而在AtLAS过表达的细胞中，CELF4与pre-syn2结合亲和性显著下降（图3i）。此外，作者发现CELF4只能结合单链Syn2b 3’-UTR，而不能结合AtLAS与Syn2b 3’-UTR形成的双链结构（图3j）。他们构建了pre-Syn2删除了CELF4结合位点的突变体，发现过表达CELF4不再影响突触蛋白IIa/b的比率（图3k-l）。他们还合成了反义链以进一步确认了CELF4与pre-Syn2的结合位点（图3m）。
综上所述，CELF4与Syn2b 3’-UTR结合，并且阻碍了Syn2b的APA，此作用反过来促进了Syn2a的表达。AtLAS阻断了CELF4与Syn2b 3’-UTR的结合作用，进而改变了Syn2a/b的表达比率。4.Syn2b而非Syn2a参与社会等级优势的形成
然后，作者探究Syn2a和Syn2b是否参与社会等级的形成过程。通过WB和qPCR方法，作者发现优势鼠的mPFC中Syn2a表达水平显著上调，Syn2b表达水平显著下调（图4a-b）。然后，他们在优势鼠的mPFC中注射AAV-CaMKII-Syn2b以在锥体神经元中实现Syn2b的过表达，并发现这些小鼠的社会等级显著下降（图4c-e）。而在优势鼠mPFC的锥体神经元中下调Syn2a表达水平，则无此现象。他们还引入了Syn-2b基因敲低小鼠模型，得到了相似结果（图4f-i）。以上结果表明，Syn-2b表达水平下调介导了社会等级优势的形成。图4 Syn2b而非Syn2a参与社会等级优势的形成
5.AtLAS/Syn2b的缺失强化AMPA受体介导的兴奋性输入
研究表明，在优势鼠mPFC第5层锥体神经元中记录到的微小兴奋性突触后电流幅度（mEPSC）更大[4]。于是，作者就AtLAS/Syn2b对mPFC锥体神经元电生理性质的影响展开进一步探究。他们在CamKII-Cre小鼠的mPFC中注射AAV-DIO-sh-AtLAS，使用膜片钳电生理方法记录mPFC锥体神经元（图5a）。他们发现，在这些小鼠锥体神经元中记录到的mEPSC幅度显著增大，AMPA受体与NMDA受体介导电流的比值（A/N ratio）也显著增加，而脉冲配对比值（PPR）不变（图5b-e）。而过表达AtLAS/Syn2b后，在优势鼠锥体神经元中记录到的mEPSC幅度显著减小（图5f-k）。此外，他们还在海马中沉默AtLAS，发现海马神经元中记录到的mEPSC幅度亦显著增加。PPR常用于表征突触前递质释放水平，因此mEPSC幅度的增加很可能为突触后作用，即由更多的AMPA受体引起。结合以上结果，AtLAS/Syn2b的缺失很可能增加AMPA受体的膜转运效率，进而强化神经元的兴奋性输入。图5 AtLAS/Syn2b的缺失强化AMPA受体介导的兴奋性输入
6.Syn2b作用于突触后AMPA受体进而调控小鼠社会等级
再然后，作者探究Syn2b是否作用于突触后的AMPA受体。通过突触各部分的分离，作者发现Syn2a、Syn2b在突触前、后均有表达（图6a-c），而只有Syn2b与AMPA受体的GluA1、GluA2亚基结合（图6d-f）。沉默正常小鼠mPFC神经元中AtLAS后，及优势鼠mPFC神经元中，细胞膜内GluA1、GluA2亚基的含量显著升高。（图6g-h）。作者还在HEK293细胞中转染突触蛋白II各亚型以及GluA1、GluA2亚基，发现只有Syn2b可以和GluA1、GluA2亚基结合，与上文假设相一致（图6i-j）。图6 Syn2b而非Syn2a作用于突触后AMPA受体
最后，为探究 Syn2b作用于AMPA受体各亚基的功能，作者设计一种膜穿透性肽——P-2B，这种肽可以干扰Syn2b和AMPA受体的结合（图7a-c）。他们发现，在培养的PFC神经元中孵育P-2B后，膜AMPA受体含量显著增加，且记录到的mEPSC幅度显著增大（图7d-h）。他们还发现，连续10天通过腹腔注射方式给予小鼠P-2B后，小鼠的社会等级显著增加（图7i），表明Syn2b和AMPA受体作用的缺失增加了AMPA受体的突触后膜转运率，进而建立起社会等级优势。图7 Syn2b作用于AMPA受体进而改变其膜转运效率与机体的社会等级
社会等级是一种存在于人类及多种动物中的保守性现象，是食物、栖息地等资源获取顺序的指导原则。研究表明，大脑mPFC在社会等级的形成过程中扮演重要角色，但究其分子机制，我们知之甚少。本篇文章结合lncRNA微阵列分析、基因沉默、基因过表达、行为学等方法，发现mPFC神经元中AtLAS可调节突触蛋白II的APA，以增加Syn2b的表达水平。Syn2b可作用于突触后AMPA受体以减少其膜转运率，进而影响mPFC锥体神经元的兴奋性传递，最终改变小鼠的社会等级（图8）。这项研究通过基因沉默与基因过表达等多种策略，在社交行为领域取得了新的进展，让我们更加了解社会等级背后的大脑！ 图8 社会等级优势鼠和劣势鼠mPFC神经元中的分子通路
和元上海有幸提供实验中使用的大量AAV工具病毒载体，用实际行动助力中国脑科学的发展。
朱铃强，三级教授，博士生导师，中组部万人计划青年拔尖人才，教育部新世纪优秀人才支持计划获得者、耶鲁大学博士后、华中学者特聘岗、国际杂志Journal of Alzheimer’s Disease（影响因子3.9）Senior Editor、全国百篇优秀博士论文提名奖获得者，湖北省杰出青年基金获得者，2016湖北省科协创新创业人才工程，华中科技大学首届学术前沿青年团队负责人，首届学术新人奖获得者。目前以通讯作者和第一作者发表Nature Neuroscience、Neuron等SCI论文70篇。
刘丹，副教授，硕士生导师，湖北省优秀博士论文获得者。研究方向：表观遗传学在神经精神疾病中的作用。承担国家自然科学基金三项。目前发表Neuron、BPS等SCI论文24篇。
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