2014
呼吸道感染由多种病毒和细菌病原体引起,是全球发病和死亡的第二大常见病因。在全球疾病负担的排名中,下呼吸道感染仅次于缺血性心脏病位居第二。欧洲的监测报告显示,由耐药细菌所致的感染数量显著增加。社区获得性肺炎、医院获得性肺炎和通气相关肺炎不断地给临床诊断和治疗带来巨大挑战。
此外,全球广泛传播的多药耐药结核和新出现的多药耐药革兰阴性菌因缺乏有效的治疗方法而成为人们关注的重点。在日渐庞大的免疫功能低下人群中,呼吸道感染也是最常见的感染,此类人群的条件致病菌感染进一步给鉴别诊断造成困难。
只有通过快速、敏感和特异地识别病原体及其耐药谱,从而开展以循证为基础的有效抗微生物治疗和病原体特异性感染控制措施,才能在所有类型的医疗保健机构中获得呼吸道感染治疗的成功。目前已经能够利用呼吸道样本中的微生物核酸进行靶标的扩增以鉴定微生物及其耐药性。
一、临床和公共卫生诊断
当呼吸道感染患者就诊于任何医疗机构时,应同时具备诊断试验以鉴别感染是由细菌(包括结核)、病毒还是其他微生物引起的,从而获得最佳的治疗效果。目前,对于急性呼吸道感染患者,主要针对细菌感染采取经验性抗生素治疗,而非直接针对致病病原体的治疗。
现阶段,在呼吸道感染临床处理方面存在的主要问题是缺乏标准化、快速、准确、特异性的床旁诊断试验,用于筛查重要病原体、识别致病病原体和明确抗微生物药物的敏感性。当前分子技术的进步为填补这一空白提供了很好的机遇。
过去
其他新出现的具有流行潜力需要密切监测的呼吸道病原体包括禽流感病毒
当一种既往未知的潜在致命性呼吸道感染病原体出现时,临床医生、微生物学家和公共卫生部门应通力合作,在国家和全球卫生系统的协助下应对这一威胁。
应对策略由多个部分组成:快速诊断和识别相似病例;开展病例对照研究以明确储存宿主、传播方式和危险因素;收集单个病例和聚集性病例的数据和报道;明确传播模式;分离、鉴定和描述特定病原体,如果可能的话建立柯赫法则;开发病原体特异性诊断试验和基因组测序以监测其演变和传播模式。
这些合作项目对识别特定微生物、指导合适的靶向治疗、监测治疗反应、预测预后、指导感染控制措施及制定公共卫生监测和控制推荐非常重要。公共卫生部门在处理由新的潜在致命病原体所致的呼吸道感染时,快速、准确的诊断试验是关键。
二、床旁检测和患者近旁检测
呼吸道感染对理想的床旁检测和患者近旁检测的要求相似(表
多种诊断平台和试验都很有可能改善呼吸道感染的处理。而且,这些方法在应对人畜共患病原体(能够跨越物种屏障而广泛传播)所致的呼吸道感染暴发中具有越来越重要的地位。多种采用上述技术且有望大大缩短微生物感染诊断周期的商用诊断试验和平台已经上市或正在研发中(表
通常为自动化或半自动化的系统或试剂盒,整合了样本制备、病原体检测和耐药基因鉴定等步骤,并自动产生读数。这些试验和平台采用最先进的系统,在整个过程中几乎不需要用户控制,并且能够同时检测多种病原体。根据不同的试验,可以检测单个或多个病原体或耐药性。
这些系统不仅可以提供更快的诊断,还可以提高检测敏感性。然而,这些试验的开发及其在临床实践中的成功实施需要进一步研究。
虽然多重检测结果的准确性高,但为了提供诊断和流行病学信息,集中检测可能更为理想,常规的诊断实验室可以考虑履行公共卫生的职能。在繁忙的三级医疗机构、门诊或发展中国家的乡村,需要将多重分子检测移至实验室以外,作为床旁检测。
此时,一种方法的基本要求可能出现差异:对于现场研究,使用的扩增技术可能需要更适合那些供电无法保证的场合,如等温扩增。对于所有的床旁检测,操作简单便于非实验室专职人员的使用以及对原始信号数据的准确解读是关键。
三、呼吸道感染诊断方法的演变
在实验室检测诞生前,医疗实践是一门艺术,呼吸道感染的诊断主要依靠询问病史和体格检查。Antonie van Leeuwenhoek(1632-1723)发明显微镜是实验室诊断试验发展的第一步,通过痰染色镜检和痰琼脂培养(后续采用液体培养方法)进行呼吸道感染的诊断。
细菌和病毒培养方法的进一步改进提高了检测特定病原体和确定其对特定抗微生物药物敏感性的能力,但培养所需时间(24-72 h)不会影响入院时的治疗决策。这些诊断方法直至 20 世纪 80 年代晚期才发生改变,当时在分子生物学、免疫学、基因组学和技术工程领域出现了重大进展,从而诞生了许多新的诊断试验。
目前已经开发了多种诊断试验用于各种病原体,包括检测微生物抗原或抗体的血清学试验、凝集试验、补体结合试验、荧光抗体试验、放射免疫法和 ELISA。这些试验对呼吸道感染的临床处理没有显著影响。最有意义的进展是将核酸扩增技术(NAAT)用于呼吸道感染的诊断。
目前已经能够利用呼吸道样本(痰、鼻咽拭子、气道吸出物和支气管肺泡灌洗液)中的微生物核酸,对特异性遗传靶标进行扩增。该方法最初需要耗费很多劳力,目前 NAAT 技术已经发展到实时 PCR(rtPCR)、环介导扩增(LAMP)、核酸序列依赖性扩增和链替代扩增,后 3 种方法避免了热循环。
四、病毒感染的诊断试验
1. 病毒诊断方法的演变
在
在过去
单一和多重
病毒性呼吸道感染的基本实验室诊断方法与分型、抗病毒药物耐药性、核苷酸多态性和病毒载量检测相结合,可以为呼吸道感染的最佳治疗提供更广泛的信息。
2. 病毒诊断方法的特征
一种试验是否适用于临床取决于其相对敏感性和特异性及出结果的时间。单克隆抗体直接荧光抗体试验往往对一种特殊病毒具有足够的特异性,但需要在检测时间和敏感性之间权衡。因此,虽然一些用于直接抗原检测的比色法可以控制在
3. 病毒多重检测的临床解读
多重检测的优点是能够增加鉴定出呼吸道感染病原体的几率,并且在有合并感染时能够同时检测
另一种可能是较弱的信号提示明显的下呼吸道病毒感染,但病毒尚未在上呼吸道很好表达,而此时上呼吸道存在另一种病毒感染。关于哪一种临床样本具有最高诊断价值的问题也取决于病毒的致病机制。
多重检测的快速发展可能超出了临床对其的需求,它不仅没有为临床医生提供有用的信息,而且使得临床解读和决策制定变得更为复杂。一项在新生儿
五、细菌性呼吸道感染的诊断试验
尽管技术在进步,但细菌性呼吸道感染诊断的金标准仍然是传统培养,然后采用各种手动或自动方法进行菌种鉴定和药物敏感性检测。个别实验室可能在一些检测步骤中使用分子方法(内部或外部开发的)。这一补充方法常用于培养困难或耗时的病原体,如百日咳杆菌、嗜肺军团菌、肺炎支原体和肺炎衣原体。
然而,培养和药物敏感性试验的标准操作通常需要花费 2-3 天,培养至少 1 天,药物敏感性试验还需要 1 天。与此同时,许多患者接受了经验性抗生素治疗。这种治疗往往是无效的、不适当的或两者兼而有之。抗生素无效常常是由于其治疗的是由耐药菌所致的感染或者非细菌所致的感染。在重度感染或免疫功能低下患者中,这种无效治疗可导致发病率和死亡率增加。
因此,临床医生常凭经验使用终极的广谱抗生素如碳青霉烯类治疗敏感菌所致的感染,使患者可能发生不必要的不良反应,并促使抗生素耐药的发生和传播。由此可见,亟需快速床旁检测和患者近旁检测技术以提高诊断的速度和准确性,从而为临床医生选择合适的抗感染治疗提供信息。
1. 现有的细菌诊断技术
呼吸道感染特定细菌病原体的实验室诊断非常困难。作为金标准的培养方法不能识别病原体的几率达
2. 检测下呼吸道细菌感染的新试验
尽管该领域已取得了显著进展,但市场上销售的平台或试验极少,而且有关这些试验临床评估的研究很少发表(表
现有的唯一一款综合性产品是
检测的耐药决定簇包括编码β内酰胺类耐药(mecA、blaCTX-M、blaDHA、blaEBC、blaOXA-51
尚缺乏对该试剂盒独立的实验室和临床评估数据,但制造商赞助的研究显示敏感性和特异性有差异。虽然总体检测的敏感性和特异性分别为
目前还没有获批的
大多数实验室报告定量结果,并且将
六、检测上呼吸道感染的试验
其他主要检测上呼吸道感染的试验包括
七、以测序为基础的呼吸道感染诊断试验的开发
传统的全基因组测序(WGS)需要有病原体的知识,而新一代测序(NGS)方法可以测定一份样本中所有的基因物质。NGS
NGS
1. 利用痰标本的
采用
一个欧洲资助的集团
纳米技术如纳米孔测序和移动设备的出现有望加快检测时间、减少占用空间和降低成本,从而使我们能够在不久的将来实现患者近旁病原体基因组测序和数据解读。
2. NGS
相较于
更高级的新一代方法包括
检测抗生素耐药特别是复杂的多药耐药病原体的难点在于快速收集和分析所产生的数据。这就需要建立强大的数据库和数据分析法则,从而快速将基因组与可能的抗生素耐药谱相联系。
八、开发新型病毒性呼吸道感染的诊断试验
MERS
在第一例
多项研究关注了血清学试验的开发和评估(表
已开发了一种无细胞的蛋白微阵列技术,利用
WGS
一篇报道称,从一名死于实验室确诊的
九、开发肺结核的快速诊断试验
全球
鉴于具有百年历史的痰镜检仍在持续使用、传统的以培养为基础的结核诊断非常耗时、以及结核的全球发病率和相关死亡率较高,促使全球致力于开发新的快速且更敏感的结核诊断方法(表
新的床旁、患者近旁结核诊断有多个目标:采用
Xpert MTB/RIF
在一项评估 Xpert MTB/RIF
虽然以结核为中心的开发诊断试验很重要,但必须认识到这不符合更长远的目标,即为非传染性和其他传染性疾病提供最佳的集中医疗保健。
尽管对结核分枝杆菌的耐药株有可能进行基因分型分析,但实验室方法仍存局限,如更快、更准确地鉴定抗生素耐药表型。痰标本的直接测序需要预先通过培养或其他富集方法进行病原体富集。以微阵列为基础的多重测序和以核酸为基础的深度测序用于同时检测结核分枝杆菌
新一代台式测序系统有可能实现对痰标本直接进行结核分枝杆菌测序以明确其对所有一线和二线抗结核药物的耐药性,并且能够解决痰标本中细菌载量较低的问题,与培养为基础的耐药检测相比,检测周期快数周。另外还需要绘制全面的抗生素耐药突变图,并开发出易于解读耐药分析结果的软件。
WGS
十、未来的需求和挑战
多家制造商正在开发有潜在价值的诊断技术,并着手将其推向市场。有必要提高对个别微生物在呼吸道疾病中的作用以及病原体数量与疾病真实关系的认识。实现分子检测的一项重要挑战是试验能否鉴别微生物是定植、感染,还是病因。标准的实验室培养通常包括定量标准,常规界值为
呼吸道标本不可避免地会受到鼻咽部定植微生物的污染,而敏感性提高的分子方法可以检测出这些定植微生物。而且,一份标本中可以存在多种病原体。这些病原体是代表了真正的合并感染还是感染与定植混合需要进一步确定。感染和定植的鉴别困难使临床医生处于两难的境地,究竟是否要用这些结果来指导治疗。在诊断试验中纳入定量方法如使用定量
目前,最大的技术缺口在于下呼吸道感染的诊断,由欧盟资助的合作联盟和创新药物计划如 PATHSEEK、呼吸道感染快速鉴定(RiD-RTI)和感染性疾病快速床旁诊断平台开发项目(RAPP-ID)正致力于该领域。
RiD-RTI
随着
未来,可能需要分
第二阶段是一种稳健的内部或大批量生产的商业化
第三阶段尚未完全建立,是一种病原体发现方法,首先对临床样本中的多聚腺苷酸
第一阶段的全自动化
自动化的使用和可靠性的改善促使诊断试验移至实验室以外进行,并且向临床医生为患者提供医疗服务的地点靠近,理想情况下,还能利用太阳能在发展中国家的农村进行检测。
十一、结论
多项技术进步带来巨大希望,虽然在病原体特异性快速诊断的开发领域取得了显著进展,但有关数据解读、敏感性和特异性方面的问题仍有待解决。围绕着高敏感性和特异性
从临床处理角度来说,对于就诊于任何医疗场所的呼吸道感染患者,需要一种快速诊断试验,该试验可以从一份呼吸道样本中鉴别细菌和病毒感染,鉴定细菌的种类,并且描述抗生素敏感性。该试验能够促使针对病原体的治疗迅速启动或经验性抗生素治疗的迅速调整,由此改善呼吸道感染患者的治疗和预后。对于任何将被推广的新试验,应能利用太阳能,并且所使用的反应物不需要低温运输储存。
重要信息
1、全球有数百万的成人和儿童持续死于由多种病原体所致的可治愈性呼吸道感染。
2、抗生素耐药细菌和具有流行潜能的新型呼吸道病毒的出现成为了全球关注的焦点。
3、只有通过快速、准确地诊断呼吸道感染的致病微生物并启动合适的抗生素治疗,才能获得最佳的临床治疗效果。
4、目前已能够利用呼吸道标本中的微生物核酸对菌种和特定的耐药基因靶标进行扩增。
5、分子诊断平台促使快速诊断试验能够利用核酸扩增技术(NAAT)在自动化平台上实现。围绕着高敏感性和特异性 NAAT 使用的临床困境是从一份呼吸道标本中鉴定出的病原体核酸可能并非来自致病病原体。
6、很少有经验证的 NAAT 试验(筛查由特定病毒或细菌所致的呼吸道感染)被诊断实验室所采纳用于诊断部分病原体,通常与更传统的方法相结合。
7、大多数发展中国家的实验室使用古老的传统方法诊断呼吸道感染,除外 Cepheid 公司的 GeneXpert MTB/RIF 检测法,该方法正在全球广泛推广,用于结核和利福平耐药的快速诊断。
8、以微阵列为基础的多重测序和以核酸为基础的深度测序用于同时检测病原体核酸和多种抗生素耐药,这些方法有望为快速床旁结核诊断带来一次革命,并且在识别新的细菌和病毒病原体方面已经显示出巨大价值。
9、虽然该领域已取得了进展,但仍亟需具有病原体特异性、敏感性且费用不高的快速床旁诊断试验,从而改善临床治疗、感染控制和公共卫生部门应对新出现病原体的能力。
编辑: infect002
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