1、选择处于对数生长期的细胞,在冻存前一天最好换液。将多个培养瓶中的细胞培养液去掉,用0.25% 胰蛋白酶消化。适时去掉胰蛋白酶,加入等量完全培养基终止消化。用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞,使其成为均匀分散的细胞悬液。然后将细胞收集于离心管中离心(1000r/min,5分钟)。
2、去上清液,加入含20%小牛血清的完全培养基,于4℃预冷15分钟后,加入10%的DMSO,用吸管轻轻吹打使细胞均匀,细胞浓度为3×106~1×107/mL之间。
3、将上述细胞分装于冻存管中,将盖子盖紧,并标记好细胞名称和冻存日期,同时作好登记(日期、细胞种类及代次、冻存支数)。
4、先将冻存管置入置于4℃/30 min,再转入-20℃/2-h后,再放入-80℃冰箱冷冻过夜,次日保存到液氮罐中。
注:细胞冻存在液氮中可以长期保存,但为妥善起见,冻存半年后,最好取出一支冻存管的细胞复苏培养,观察生长情况,然后再继续冻存。
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