哺乳动物稳定细胞系是指通过外源基因转染真核细胞后整合入基因组DNA，能够长期存在于细胞中，随染色体复制而传给子代，可以稳定表达目的基因的细胞系。哺乳动物稳定细胞系的生产工艺开发过程通常包括分子构建、稳定细胞系筛选、上游发酵工艺开发、下游纯化工艺开发以及制剂工艺开发。其中，分子构建和稳定细胞系筛选作为蛋白产品开发的起始部分，具有极其重要的意义。一株稳定高产的工程细胞株不仅能显著增加单位体积产量，降低产品的生产成本，还可以降低下游纯化过程的复杂度，确保获得安全，高质量的蛋白产品。
工业上利用哺乳动物系统生产重组蛋白的方式有两种：瞬时转染和稳定转染。瞬时转染通常用于制备少量蛋白，用于药物开发早期的蛋白活性检测。瞬时转染并不产生克隆细胞株，它只是暂时将编码外源蛋白的质粒转导入宿主细胞，如HEK293或COS细胞。随着细胞的分裂，外源基因不断丢失，因此蛋白产量较低。与瞬时转染不同，稳定细胞株是为工业化生产治疗性蛋白而构建的。稳定细胞株需要具备在不同的时间，不同的场地以及不同的批次间生产相同质量蛋白产品的能力。
01 转染
转染是指通过质粒将编码目的蛋白的外源基因导入到宿主细胞内的过程。质粒上除了目的基因外还带有抗性基因，比如抗生素抗性基因。这样在转染后就可以利用选择压力富集整合了质粒的宿主细胞。在哺乳动物细胞中质粒不能复制，因此，未整合到基因组中的质粒将随细胞分裂而逐渐丢失。在一段时间的选择压力后，所有存活下来的细胞基因组中都整合了外源质粒。
外源基因是以质粒DNA的形式进入动物细胞的，同时质粒DNA上带有提高外源基因转录和翻译水平的元件。尽管病毒来源的载体和细菌来源的载体都被用来将外源基因导入动物细胞，但是工业上在构建细胞株的过程中极少用到病毒来源的载体。
目的基因可以由组成型，诱导型或条件型启动子进行启动转录。在细胞分化和发育的研究中经常用到条件型启动子，它可以由某些特定因素引发，导致蛋白表达，影响细胞的分化。但是在重组蛋白的生产中，绝大多数表达载体使用组成型的启动子。通常病毒来源的启动子，如SV40晚期启动子和CMV启动子，应用最为广泛。
为了提高转录水平，除了使用强的启动子外，还可以在目的基因中插入内含子。表达载体除了包含启动子、增强子和目的基因外，还需要有筛选标记基因，甚至，扩增标记基因。
02 筛选
获得了一系列整合了外源基因的稳定细胞后，接下来需要从中筛选出表达量最高的克隆。通常使用二氢叶酸还原酶（DHFR）或谷氨酰胺合成酶（GS）法。以GS法为例，绝大多数哺乳动物细胞内源的谷氨酰胺合成酶活性很低，需要在培养基中额外添加谷氨酰胺，细胞才能生长。GS筛选系统的载体含有谷氨酰胺合成酶，因此可以在不含谷氨酰胺的培养基中进行筛选。通过在培养基中添加L-氨基亚砜蛋氨酸（MSX）抑制细胞谷氨酸的合成，经过初步筛选和评估，选取表达量最高的几个克隆。使用浓度不断增加的MSX梯度培养基，从而筛选出含高拷贝目的基因的细胞，进而获得稳定的高产量细胞株。
通过为期一到两周的基因扩增过程，筛选试剂浓度相应降低。在较低的筛选压力下，外源基因的拷贝数可能减少，导致转录水平和蛋白产量的下降。拷贝数的丢失与外源基因整合到染色体上的位置有关，位于染色体两臂末端的基因更倾向于丢失。通常在降低筛选压力后，细胞株先是经历一个外源基因拷贝数和表达量迅速下降的过程，随后便趋向于稳定。所以，通常需要维持一个合适的选择压力来防止细胞不利突变的发生，影响拷贝数或引起细胞生长速率的变化。
03 细胞株稳定性测试
体外培养的细胞发生基因突变和表观遗传学改变的几率很高。通过转染、扩增、筛选获得的生产重组蛋白的高产细胞株更不稳定。首先用于高产细胞株构建的非整倍体宿主细胞本身的稳定性就低于二倍体细胞。非整倍体宿主细胞除了染色体数目异常外，还存在染色体结构畸形。这就导致了即使是同一宿主细胞来源的细胞株也会具有不同的核型。核型差异和染色体畸形是高产细胞株的遗传特性。然而即使生产用细胞株在稳定性上可能不及二倍体细胞，但是他们必须具备在一定的倍增次数内保持其生产特性、生长状况、蛋白质量的相对稳定。为了测试细胞的稳定性，需要对细胞40-60次倍增范围内的生产能力以及基因拷贝数进行检测。蛋白产品质量稳定性更难评估，基因突变，比如糖基转移酶突变，会影响产品质量。一个或多个拷贝中碱基突变会影响到蛋白氨基酸序列。由于基因组中外源基因不同拷贝的转录和翻译效率不同，不同的突变导致的对产品质量的影响也不尽相同。通过高通量基因测序技术，可以检查出细胞群体中甚至很小水平的突变。
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