细胞冻存的准备及步骤

（1）物品准备：

超净工作台、酒精灯、废液缸、移液枪、培养瓶或培养皿、培养基、15ml离心管、0.01mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）、0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA混合消化液、二氧化碳培养箱、倒置显微镜、DMSO、胎牛血清、离心机、冻存管等。

（2）步骤：

①配制含10%DMSO冻存培养液（DMSO:FBS=1:9 或 DMSO:FBS:培养基=1：2：7）。
②取对数生长期细胞，去除旧培养液，用PBS清洗1-2次。
③去除PBS，加入适量胰蛋白酶(覆盖培养皿表面)把单层生长的细胞消化下来。

④将细胞悬液转移到15ml离心管中，并置于离心机中，800-1000rpm，室温离心5分钟。⑤去除细胞上清，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数,调节冻存液中细胞的最终密度为5.0x10⁶/ml-1.0x10⁷/ml。

⑥将细胞分装入冻存管中，每管1-1.5ml。

⑦在冻存管上标明细胞名称及代数、冻存时间、操作姓名。

⑧冻存：标准的冻存程序为降温速率4℃（30min）→ -20℃（1h）→ -80℃（过夜，至少8小时为宜）→ 液氮罐。