RNA-FISH技术原理介绍

FISH当然不的鱼的意思，FISH是指荧光原位杂交技术(Fluorescene in situ hybridization, FISH)的缩写。FISH是在20世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术。是利用DNA碱基互补配对的特点，在体外一定的条件下，使同源的DNA链或DNA-RNA单链结合成双链，以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法。

下面分享下RNA-FISH心得体会

• 前期标本制备和蛋白酶K的作用浓度：蛋白酶K浓度影响细胞核形态，造成模糊不清，浓度低了则探针不易进入细胞核，杂交率大大降低。
• 探针标记：就是一句话--买好点的。
• 杂交：这步的动作要领是轻柔地按一点。另外我师兄告诫我：在封片时，一定要密封好玻片，可以采用凝胶类的物质封住四                周。杂交条件：孵育时间一般20h左右。温度要严格控制在36-40℃之间，过高或者过低都是不适合的。
• 显带：感觉没啥要注意的细节~
• 显微镜观察：封片后标本要尽快检测和观察。每一次荧光显微镜的观察都会淬灭一部分信号，因此一定要快速观察和采集图像。

举个栗子：

在下面这篇文章[5]中，作者分析了两个果蝇的睾丸单细胞RNA序列(scRNA-seq)数据。作者发现有证据表明，X染色体在体细胞和减数分裂前细胞中的转录活性与常染色体相同，而在减数分裂和减数分裂后细胞中的转录活性低于常染色体。通过scRNAseq和RNA-FISH，作者发现大多数msl（male-specific lethal）基因MLE、roX1和roX2的胚系表达水平很低或检测不到，没有胚系核roX1/2定位的证据。scRNAseq和RNA-FISH的结果相似互相印证。