慢病毒载体(Lentivirus, LV)是细胞和基因疗法常用的递送载体之一,它的主要功能是将目的基因转移并整合到宿主细胞的基因组中,可以用来研究基因水平上的生物学调控机制。作为一种宿主范围很广的病毒载体,它们能够转导分裂和非分裂细胞,例如神经元、造血干细胞和免疫细胞,尤其是T细胞。近年来,慢病毒转导技术已经成功应用于CAR-T细胞的制备。本文将为大家介绍慢病毒载体制备的基础知识以及一些应用。
从HIV到慢病毒多质粒系统
慢病毒载体系统基于人类免疫缺陷Ⅰ型(HIV-1)病毒改造的,这是一种经过充分研究的人类病原体病毒。目前广泛应用于科研及临床研究的慢病毒四质粒包装系统,属于第三代慢病毒包装系统,由1个包含目的基因的表达质粒、2个包装质粒、1个包膜蛋白质粒组成。
包装质粒中含有包装、逆转录及整合所需的顺式序列(RRE,ψ,LTRs),及目的基因或标记基因(绿色荧光蛋白GFP)。其中1个包装质粒包含Gag和Pol基因,Gag编码核心蛋白(基质蛋白、衣壳蛋白、核衣壳蛋白),Pol基因编码前体蛋白,经切割形成反转录酶、整合酶、蛋白酶,另1个包装质粒包含REV基因,其编码的Rev蛋白与慢病毒基因组中的RRE结合,将基因组mRNA从细胞核转运到细胞质中。
包膜蛋白质粒使用水疱性口炎病毒糖蛋白G基因(VSV-G)来替代原病毒的env基因,应用VSV-G包膜的假构型慢病毒载体扩大了载体的靶细胞嗜性范围,同时也增加了载体的稳定性。
基因组mRNA与衣壳蛋白、包膜蛋白等组装成假病毒颗粒。四质粒包装系统,极大地降低了产生具有复制能力慢病毒的可能性,而VSV-G蛋白的使用也降低了这种重组的可能性。
图1. 第三代慢病毒的4质粒系统[1]。
慢病毒是一种研究工具
利用慢病毒载体,可以稳定地过表达特定基因、研究启动子的调控机制、或利用RNA干扰技术来沉默特定基因的表达等。慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。为了提高转染细胞的效率,需要获得高滴度的病毒颗粒,这和包装用的细胞状态、目的基因的大小、质粒质量和收毒时机有关。包装好的病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中,离心取得上清液后,可以直接用于宿主细胞的感染,目的基因递送到宿主细胞之后,经过逆转录整合到宿主细胞基因组中,从而高水平地表达相应的蛋白。
根据不同的实验目的,可以选择相应的慢病毒载体,例如:
☑ 常规功能基因过表达/干扰慢病毒
☑ 非编码miRNA/lncRNA/circRNA慢病毒
☑ 基因敲除慢病毒
此外,也可以选择不同的启动子、筛选标记、表达标签或者报告基因等,满足个性化的研究需要。
图2. 慢病毒包装技术路线。
应用案例
1
●
慢病毒转染T细胞
静息状态是免疫系统的一个独特特征,T淋巴细胞可以长时间保持不分裂状态[3]。血液中的大多数循环T细胞处于静息状态,其特点是代谢率低、转录水平低、体积小和生存期非常长[4]。
在Zack等人对HIV病毒的研究中[3],详细介绍了HIV病毒感染静息状态下T细胞的局限性。首先是静息T细胞中HIV的预整合受到抑制,和激活的T细胞相比,病毒的感染能力不变,但是逆转录存在明显差异,比如逆转录速度较慢、病毒cDNA不稳定等。其次,在静息T细胞中HIV表达存在缺陷,包括LTR缺陷、基因整合到转录抑制区域。
已有多项研究表明,包括亲本病毒HIV-1及其衍生载体在内的病毒系统可以进入静息状态下的T淋巴细胞,但不会复制[5]。主要包括:
1.逆转录的启动以及完成过程中存在缺陷
2.缺乏ATP依赖的核输入
3.缺乏前期病毒基因组的整合
基于HIV的慢病毒载体系统在静息T细胞中的转染仍有难度。因此在转染前需要对T细胞进行激活。例如,通过T细胞受体和 CD28 共刺激受体的刺激,使用抗CD3 、抗CD28抗体,诱导静息T细胞进入细胞周期的 G1b期,可以使细胞易受HIV-1感染和复制[6]。或者将T细胞暴露于不触发细胞分裂的细胞因子也可以使HIV-1载体完成转导[7]。
图3. 慢病毒转染T细胞案例。上:PBMC活化扩增第十天T细胞占比及表型分析实验结果。下:FMC63 CAR-T细胞CAR阳性率检测结果。
2
●
慢病毒感染RPE细胞
Leber 先天性黑蒙 (LCA16)是一种遗传性儿科失明,由KCNJ13基因的致病变异引起。KCNJ13基因编码一种结构为四聚体的 Kir7.1 亚基,该亚基在视网膜色素上皮 (RPE) 中内向整流钾离子通道,维持离子稳态并且使光感受器能够编码视觉信息。
在Pawan K. Shahi等人的研究中[8],验证了KCNJ13基因与Kir7.1通道的作用机制。首先,该研究组获得了KCNJ13基因缺陷的人类诱导多能干细胞(hiPSC)-RPE细胞,并验证了该细胞具有正常形态但不表达功能性Kir7.1通道,因此不具备生理活性。为了探究KCNJ13基因对Kir7.1亚基表达的影响,该研究组使用了慢病毒pLV-EF1α Kir7.1-GFP,成功地将KCNJ13基因递送至hiPSC-RPE细胞,并且恢复了Kir7.1通道功能。第三代慢病毒包装系统降低了产生可复制病毒的风险,在转导有丝分裂后RPE细胞中的效率更高。
图4. 使用慢病毒转染后,hiPSC-RPE 细胞膜电位恢复正常[8]。A-C:慢病毒递送基因后膜电位恢复;D:免疫印迹分析;E:使用慢病毒转染后,hiPSC-RPE成功表达Kir7.1(绿色)。
联系客服