原位杂交实验技术服务

【技术原理】

原位杂交（in situ hybridization）是应用已知碱基顺序并带有标记的核酸探针与组织、细胞等样本中待测目的基因按碱基配对原则进行特异性结合而形成的杂交体，然后再用与标记物相应的检测方法，在被检测的核酸原位形成带颜色的杂交信号，从而在显微镜下进行目的基因的定位检测观察。主要检测方法分为DAB显色和荧光显色两种。

【实验流程】

【常见问题】

1、RNA探针长度以50-150bp为佳，探针已进入细胞，杂交率高，杂交时间短。

2、原位杂交反应中探针浓度应超过靶序列的浓度，探针浓度必须给予该实验最大信噪比，因为背景着色度高低与探针浓度有关。

3、杂交温度应低于解链或溶解温度20-30℃。杂交反应的时间可随探针浓度的增加而缩短，杂交时间过短会造成杂交不完全，杂交时间过长会增加非特异性着色。

4、组织固定或蔗糖脱水不好会使组织有较多的空泡。

【注意事项】

1、固定液的选择及固定时间

     石蜡组织建议用10%中性缓冲福尔马林（含1/1000 DEPC）固定1～24h，其它固定液对实验结果可能产生一定的影响。

2、组织切片和载玻片的选择

     组织切片4～5μm 厚，过厚或过薄的切片均会对信号的强弱产生影响，而且切片应完整，质量良好，否则会在预处理时掉片。载玻片的选择建议使用防脱载玻片，有条件的可使用更好的阳离子或者阴离子专用载玻片，可有效防止脱片现象的发生。

3、实验过程中切片的预处理

   切片预处理过程包括煮沸处理和蛋白酶消化。当组织处理不规范、切片过厚或烤片不足时，在煮沸过程中容易掉片，建议烤片温度在56℃过夜。煮沸过程中要严格控制实验温度和时间。