悬浮细胞基因敲除技术构建流程详细介绍

1.  悬浮细胞选择：

增殖快，容易形成克隆，细胞无多倍体现象，细胞不会出现分化，培养基简单，没有支原体污染；

2.  悬浮细胞检测：
1）细胞倍增时间检测
2）细胞的安全检测
3）细胞的基因拷贝数查询
4）细胞的转染效率测试

3.  细胞基因敲除策略：
1）可以使用片段敲除的策略
2）细胞敲除的基因对细胞增殖没有影响（如果有影响一定要使用单克隆扩增）

4.  敲除细胞单克隆：
1）极限稀释法，通过不断的稀释使得每个孔只有一个细胞；
2）由于悬细胞的悬浮增殖，很难判断每个液体层都没有细胞；

5.  基因敲除功能验证：
1）先要对细胞做PCR检测，保证片段敲除；
2）Q-PCR检测看看在mRNA水平的敲除效果；
3）做WB看看蛋白的效果和生物表型的影响。