基因敲除是生物领域开展研究的重要手段,而同源重组是最经典、应用非常广泛的一种敲除方法。顾名思义,同源重组就是利用同源片段将目的基因截短、删除或者替换,使基因失活从而实现敲除的目的。
这里,以细菌为例,介绍用敲除质粒将基因截短的原理,过程可以分为两大部分:单交换(发生一次交换)和双交换(发生两次交换)。
这里用蓝色表示基因组,将要敲除的目的基因分成三段:A、B、C。B是要截去的片段(有时可能基因较短,选取时可以延伸到基因上下游间区);用黄色表示构建好的敲除质粒,A和C我们称为上、下游同源臂,将目的基因的B段敲除,利用的就是质粒和基因组的A、C同源臂发生同源重组(至于为什么需要两个同源臂,看完整个过程你就会明白啦)。
因为有两个同源臂,所以单交换的发生有两种情况,即发生在A,或发生在C。在这里,我们先列出一种情况——发生在A,让我们把目光聚焦到A上:
敲黑板划重点!
同源重组是发生在两段同源序列上(同源说简单点就是相似度很高,体现在这里就是正义链和正义链,反义链和反义链),所以过程中图里的5’和3’端大家一定要看好啦。
此A牵起彼A的手说:初次见面请多关照啊~
从平面图来看,就是将下半部分像拧麻花一样逆时针拧一下,形成了“井”字,即Holiday结构。
Holiday结构有两种拆分方式:
左图即质粒成功整合到基因组,发生单交换。
在此单交换的基础上,同源臂再次发生重组,有两种情况——在同源臂A发生重组、在同源臂C发生重组。
为了方便大家看,把单交换横过来:
交换过后前端来自质粒的A用黄色表示,前端来自基因组的A用蓝色表示:
接下来又要开始找朋友啦~
贼开心
为什么会扭成这个样子?
因为两段同源的序列才会发生重组(友情提示:上一个图中外侧两条链是同源,同样,内侧两条链也是)。
接下来的交换过程和单交换是一样的:
拆分结果显而易见,左图基因组上的基因还是ABC,并没有截短,右图还是单交换的状态,所以,单交换发生在A,双交换也发生在A是不能成功敲除目的基因的。
那么,双交换发生在C呢?
让我们把目光聚焦到C上:
黄色表示质粒上的C,蓝色表示基因组上的C。接下来的过程和双交换发生在A是一样的:
可以看到,左图基因组上的基因变成了AC,说明敲除成功;右图仍然保持单交换状态。
总结
如果单交换发生在A,双交换只有发生在C,才能达到敲除的目的;同样,如果单交换发生在C,那么双交换发生在A,基因才能敲除成功哦~ 说到这里,大家知道为什么要设计上下游两个同源臂了吧!
当然,敲除质粒是多种多样的,一般都带有抗性等一些筛选标记以便筛选出单交换,也同时会有些致死基因在筛选双交换的时候起作用;同样,替换的原理跟截短是一样的,万变不离其宗。
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