Western Blot内参抗体蛋白的基本选择原则

内参抗体种类很多，比如β-actin、β-tubunlin、GAPDH、Lamin B等，那么针对自己的实验，我们该如何选择呢？下面简单介绍下选择内参抗体应遵循的原则：

一. 样本种属来源：

首先要考虑的就是实验样本来源于什么物种？

1) 哺乳动物的组织或者细胞样本，通常选择β-actin、β-tubulin、GAPDH、Lamin B、Histone H3等。

2) 植物来源实验样本，则可以选择plant actin、Rubisco等。

3) 其他来源样本研究较少，所以就应该参照文献报导，选择合适的蛋白作为内参。

二. 目的蛋白分子量：

选择内参抗体时，应该考虑目的蛋白分子量的大小。通常应该保证目的蛋白与内参蛋白分子量相差5KD以上。比如目的蛋白分子量为45KD，此时不适宜选择β-actin作为内参，可以考虑选择GAPDH或者β-tubulin作为内参。

三. 目的蛋白表达部位：

就一般的蛋白检测来说β-actin、β-Tubulin抗体等就可以了，而针对于核蛋白的定量，特别是样本蛋白就是核蛋白时，选择恰当的核蛋白内参则更能体现内部参照的价值。常用的核内参抗体有Lamin A、Lamin B、Histone H3，除此之外，其它常见的核蛋白内参还有PCNA、K70、K80等，在一些文献报道中，Erk2、TATA binding protein(TBP)以及c-Jun、c-Fos等都有使用。对于线粒体蛋白的检测，常用VDAC1和COX IV作为内参抗体。

以上几条原则只是针对通常情况，需要注意的问题是内参的选择还需要考虑实际的实验条件，比如某些细胞中，由于组织缺氧、糖尿病等因素会导致GAPDH的表达增高，不适合做内参。比如在涉及细胞增殖相关试验中，c-Jun由于自身表达变化就不适合做内参；而在凋亡实验时，TBP、Lamin等也不适合作为内参。因此设计实验方案的时候应该考虑这些因素并查询相应文献，在实验过程中也应该注意如果内参表达出现异常，应考虑这方面因素。

我们知道，要用Western Blot比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少，前提条件是等量的细胞上样，才有比较的基础。尤其是表达量不高时，上样量的差别就很可能影响结果的分析。