F0代小鼠基因型鉴定的步骤:
待小鼠成长至5—7天,剪取小鼠脚趾,放入1.5ml洁净离心管中;
加300μl裂解液(预先加入胰蛋白酶),离心使小鼠脚趾沉淀至管底;
55℃放置5 hours,使之充分消化,然后取出短暂离心;
加入等体积酚氯仿,混合均匀,12,000rpm离心5min;
吸出上清并丢弃,加入等体积三氯甲烷,轻轻混合均匀,并于4℃,12,000rpm离心10min;
吸尽上清,加2.5倍体积的无水乙醇和0.1倍体积的NaAC(3M,PH=5.2),-20℃放置30min;
取出后在4℃,12,000rpm离心5min,观察管底是否有白色沉淀产生。同时除去液体,室温静置使乙醇充分干燥挥发,最后用灭菌纯水进行溶解,测定溶度;
以提取的小鼠基因组为模板,用预先设计的鉴定引物进行PCR反应,扩增带有突变位点的DNA条带;
使用PCR仪进行DNA片段退火处理,设置程序如下:
95℃ 5min
95℃ 30 s , -1℃/ Cycle x60 cycles
25℃ 3min
16℃ ∞
在退火后的DNA片段中加入T7E1酶,37℃酶切30—60min,1%琼脂糖凝胶进行电泳,如有多条带产生(Wild Type DNA片段没有)则该小鼠目的基因有突变;
将T7E1酶切鉴定的阳性结果小鼠DNA扩增片段连接至T载体中,转化涂板后挑取4—8个克隆,并进行测序,从而确定F0代小鼠具体基因突变信息。
T7E1酶切体系
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