1、Western Blot可以除掉电泳缓冲液里面的污染盐 (contaminating electrophoresis buffer salts)这种盐可以提高转渍缓冲液的导电性(conductivity),让其增加了整个转渍系统的热量产生。假设您用PVDF膜的话就更需要小心了,因为它对十二烷基硫酸钠(SDS)的浓度非常敏感。SDS浓度过高的话会抑制蛋白的结合能力,甚至使已经结合的蛋白脱落。
2、Western Blot能够使您的凝胶在转渍前收缩到不会变的大小(shrink to its final size)
这个需要考虑两个方面:个,转渍系统中产生的热量可以使凝胶膨胀扩大;**个,聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel)经常会在含有甲醇的溶液里收缩(大部分转渍液都用甲醇!)。所以,可以提前冷藏转渍液并且让凝胶浸泡在转渍液里至少五分钟。不过假如您的目标蛋白很小的话,需要平衡凝胶少于五分钟,不然分子量较小的蛋白就会从凝胶中扩散(diffuse)到溶液里面了。
3、Western Blot能否防止凝胶和转渍膜变干
假如您刚好有其他的实验要做,就不妨让凝胶和转渍膜浸泡在转渍液里等候一下,这样能够更好的安排其他的时间。通过网上经验,使用PVDF膜和半干转渍系统转移高分子量的蛋白,浸泡2小时是不影响转渍效率的。不过需要注意这仅适用于分子量比较大的目标蛋白。并且若您有所怀疑的话,建议还是别等太久。
那么到底是否需要平衡呢?终还是取决于您的转渍系统:
湿转渍(Wet transfer): 需要!
半干转渍(Semi-dry transfer): 需要!
快速真空转渍(Rapid vacuum transfer): 不需要! 这样的系统不需要电流回路,所以污染盐不会影响。而且转渍很快,凝胶也不会收缩。
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