1、收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度,每孔参入100ul,铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔,(边缘孔用无菌PBS填充)。
⒉、5%CO2,37℃孵育,至细胞单层铺满孔底(96孔平底板),参入浓度梯度的**,原则上,细胞贴壁后即可加药,或两小时,或半天时间,但我们常在前**下午铺板,次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个,否则难以反应真实情况
⒊、5%CO2,37℃孵育16-48小时,倒置显微镜下观察。
4、每孔参入20ulMTT试剂溶液(5mg/ml,即0.5%MTT),继续培养4h。若**与MTT能够反应,可先离心后弃去培养液,小心用PBS冲2-3遍后,再参入含MTT的培养液。
5、终止培养,小心吸去孔内培养液。
6、每孔参入150ul二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解。在酶联**检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。
7、同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜),对照孔(细胞、相同浓度的**溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)
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