CD4+ T 细胞体外刺激制备流程

1. 按照小鼠或人源CD4+ T 细胞分离kit (Thermo) 说明书分离得到CD4+ T 细胞。

2. 取所需体积的PBS，按照5 μg/ml的终浓度加入Anti-mouse CD3e和Anti-mouse CD28抗体，500 μl/孔包被 Non-Treated 24-well plate，室温放置4h，吸掉抗体悬液，加入500 μl 1% BSA（PBS配置）室温封闭30 min，封闭结束加入500 μl PBS洗孔一次。

注：请在分离细胞的同时准备好平板，包括后续感染所需的量。

3．将分离得到的CD4+ T按照浓度5´10⁵ cell/ml重悬在完全T细胞培养基中（1640, 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin, 50 mM β-mercaptoethanol, 100 U/ml IL-2），将细胞加入步骤2中包被处理好的平板，2 ml每孔（1´10⁶ cell/well），然后放入37℃ CO2培养箱刺激培养48h。细胞在刺激24h后体积略微增大，进入活化状态，刺激48h后可进行病毒感染。

四. CD4+ T细胞感染（以过表达GFP的病毒为例）

1. 收集活化好的CD4+ T细胞，400g离心5min。用T细胞培养基重悬计数备用，在收集的过程中发现有些细胞会贴壁，此为正常现象，可反复吹打至贴壁的细胞也呈悬浮状态。

2. 另取一Anti-mouse CD3e和Anti-mouse CD28抗体包被好的24孔板，每孔加入2-5´10⁵的细胞（若为96孔板，加入2´10⁴细胞/孔）。若考虑长期表达目的基因，按MOI=50-100加入T细胞专用逆转录病毒mTRv-GFP或者hTRv-GFP，注意鼠源和人源原代T细胞所适合的逆转录病毒种类差别；若考虑瞬时（一周以内）表达目的基因，可按MOI=500-1000加入悬浮细胞专用腺病毒Ads-GFP。同时加入polybrene至终浓度6 ug/ml，最终感染体积为500 ul，加入病毒后轻轻吹打混匀。

注：具体MOI选择可在96孔板中预实验进行梯度摸索，对于逆转录病毒建议使用10，30，100的梯度进行，对于腺病毒建议使用500，1000，1500的梯度进行摸索。

3. 24-well plate于1000 g 室温离心感染90 min。离心结束后将平板放入37℃ CO2培养箱感染6 h。

注：离心结束观察细胞分散状态，除非细胞全聚集在一处，否则不建议吹散细胞。

4. 感染结束后取出培养板，小心吸掉感染孔中350ul的培养基（70%），加入1.85 ml的T细胞完全培养基补足体积为2 ml并吹打混匀。

5. 可选步骤：病毒感染24h后，小心吸掉培养基，在同一培养皿中按照2-4步进行病毒复感染操作。

6. 将细胞放入37℃ CO2培养箱继续培养，2-3天后可观察荧光，做流式检测感染效率。正常情况下，T细胞专用逆转录病毒（mTRv和hTRv）和悬浮细胞专用腺病毒（Ads）感染原代T细胞的效率大于50%。

注：感染后刺激的细胞增殖较快，请注意观察细胞密度并使其维持在1´106/ml左右。此外，如果需要让细胞增殖较长时间，为了防止其过度活化，可撤掉抗体的刺激。