CRISPR/Cas9载体属于几种新兴的基因组编辑工具之一，可以快速有效地在基因组的靶位点产生突变（另外两种应用广泛的是ZFN和TALEN）。这些质粒载体编码序列特异性RNA介导的DNA核酸酶（或切口酶），可用于编辑基因组中特定位点的DNA序列。
Cas9属于RNA引导的DNA核酸酶，是天然原核免疫系统的一部分，赋予细菌对质粒和噬菌体等外源遗传物质的抗性。在细胞内，Cas9核酸酶与引导RNA（gRNA）形成复合物，该复合物通过与基因组中的18-22 nt的同源靶序列直接相互作用提供靶向特异性。gRNA与靶位点通过互补配对使Cas9定位到靶序列上，然后切割基因组中的靶位点。
常规质粒gRNA特异性检测载体设计用于测试CRISPR/Cas9对一个或多个gRNA靶序列的切割效率。该系统允许用户通过比对多个gRNA靶位点来筛选出最有效的CRISPR/Cas9靶点。
常规质粒gRNA特异性检测载体系统的基础是位于强启动子EF1A下游的无活性且分隔开的EGFP ORF。将待测试的gRNA靶位点克隆在两个不完整的无功能性的EGFP ORF（称为EGFP-L和EGFP-R）之间。EGFP-L由EGFP ORF的上游468 bp组成，EGFP-R对应于EGFP ORF下游的268 bp-720 bp。EGFP-L的3'末端的200 bp与EGFP-R的5'末端的200 bp具有序列同源性。
当常规质粒gRNA特异性检测载体单独转染到细胞中时，不会观察到绿色荧光，因为EGFP-L和EGFP-R都不编码功能性荧光蛋白。然而，如果将该载体与Cas9和相应的gRNA载体一起共转染到细胞中，则gRNA-Cas9复合物将被募集到EGFP-L和EGFP-R之间的gRNA靶序列，从而切割产生双链DNA断裂（DSB），随后EGFP-L和EGFP-R的同源区域发生同源重组。同源重组将产生完整的功能性EGFP ORF，继而产生绿色荧光蛋白。在该系统中，可以在EGFP-L和EGFP-R之间串联克隆多个gRNA靶位点（每个都应包含PAM序列），并且可以通过与Cas9和相应的gRNA共转染分别测试。通过分析产生EGFP荧光细胞的效率，比较不同gRNA靶位点被CRISPR/Cas9切割的效率。
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