师妹:师兄,我的 Cre 到底有没有起作用啊?为什么基因还在表达?
师兄:先别急,再做一次基因型鉴定试试。确定是 Flox 纯合子同时 Cre 阳性吗?
师妹:我已经 P 了 3 次了,错不了。
师兄:那你是怎么鉴定你要敲除的基因还在表达呢?
师妹:mRNA 水平都没有变化…
师兄:RealtimePCR 引物设计在哪?我记得你敲除的是基因的 exon6 吧,如果你的一对引物都设计在 exon6 之前,那么 exon1-5 还是有可能被转录出来,表达量上就可能看不出差异了。
师妹:哦,我明白了,那我重新设计引物试试。一条引物放在被敲除的 exon6 上。
师兄:如果真的没敲掉,说明你的 Cre 小鼠重组效率可能不容乐观啊。你也许要考虑找个全身性敲除的小鼠来交配一下,用 KO/Flox 杂合子同时 Cre 阳性的小鼠作为敲除组,这样 Cre 只需要在一个等位基因上起作用就可以了,敲除效率可能会提高一些。
另外,其实不同基因的 flox 有的容易被 Cre 重组,有的则比较困难。这可能是由于染色体的状态导致 Cre 酶比较难接近 loxp 位点的关系。
联系客服