CRISPR基因编辑细胞稳转株构建技术原理

构建CRISPR基因编辑细胞稳转株是当今研究基因和细胞功能关系的流行工具。通过gRNA引导Cas9靶向靶细胞基因组特定序列的CRISPR基因编辑，如基因敲除、敲入和定点突变，可以从DNA水平修饰靶细胞的基因序列。提供两种gRNA表达模式，第一种是转导gRNA/Cas9共表达载体，gRNA和Cas9在细胞株中同时表达。第二种是构建Cas9表达稳转株，再根据实验需求导入gRNA表达载体。使用单Cas9表达稳转株可以获得更大的实验灵活性，如导入多个gRNA打靶GOI，或者多个gRNA与多种Cas9（野生型Cas9, Cas9n, dCas9等）之间进行搭配等。

CRISPR基因编辑系统可选择单gRNA或双gRNA表达方式。双gRNA表达载体常用于以下需要两个gRNA同时打靶的场景：1）双gRNA引导两个Cas9 nickase分别打靶靶位点的正反义DNA链，形成DSB并获得比单gRNA更特异的打靶效果；2）通过在形成两个DSB，实现目标序列的大片段删除；3）同时打靶两个不同的基因。双gRNA表达载体由两个U6启动子驱动gRNA的表达。