免疫共沉淀实验大致流程为:收集蛋白样品—诱饵蛋白抗体沉淀诱饵蛋白—SDS-PAGE 分离蛋白—WB 检测是否存在靶蛋白。
实验步骤详解:
一、细胞总裂解液的制备
① 转染后24h收集细胞,1400r X 3min,4°C离心,弃去上层培养基
② 冰上静置裂解细胞,加入预冷的非变性裂解液NETN(20mMpH8.0Tris HCl,100mMNaCl,1 mMEDTA,0.5% Nonidet P-40)吹打混匀,冰上静置10-15min。注意NETN用时要现加蛋白酶抑制剂,通常是Leupeptin和Aprotinin这两种(终浓度为1ug/ml)
③ 12000 x 5-10min, 4°C离心
④ 将离心后的上清液转移至新的EP管内,每管转移的量保持一致,注意不要吸到底部沉淀,全程冰上操作
二、免疫共沉淀
① 留取20ul左右细胞裂解的上清液加2 x loading buffer煮5min,作为input组
② 提前将琼脂糖凝珠(S beads)均分至新的EP管内,要使用剪去了尖头的枪头吸取beads,且保证每管里的beads量一致,小心吸去上清液,加入A蛋白的抗体和细胞裂解后的上清液。1mg蛋白裂解液加入25ul悬浮液包括 1:1的 S beads与2ug A蛋白抗体
③ 4°C摇床孵化2-4h(期间可以配制SDS-PAGE胶,准备下一步Western blotting)
④ Binding结束,1400r x 1min, 4°C离心
⑤ 真空泵或移液枪吸去上清,注意不要吸到沉淀,加入800ul NETN,上下颠倒混匀,保证底部的沉淀悬浮起来
⑥ 离心,重复4)5),洗beads三次
⑦ 最后一次弃去上清,用点样枪头将残液吸净,加15ul 2xloading buffer煮5min,作为Co-IP组点样,剩下的沉淀再次加入10ul 2 x loading buffer煮一次,作为IP组点样。
三、Western blotting检测
① 点样顺序通常按照Co-IP组、Input1、Marker、IP组、Input2,跑胶。
② 转膜,封闭后Co-IP组、Input1加入蛋白B的抗体,IP组、Input2加入蛋白A的抗体4°C进行孵育。
③ 回收一抗,室温孵二抗。
④ 显影,观察实验结果。
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