免疫共沉淀技术实验步骤

免疫共沉淀实验大致流程为:收集蛋白样品—诱饵蛋白抗体沉淀诱饵蛋白—SDS-PAGE 分离蛋白—WB 检测是否存在靶蛋白。

实验步骤详解：

一、细胞总裂解液的制备

①　转染后24h收集细胞，1400r X 3min，4°C离心，弃去上层培养基

②　冰上静置裂解细胞，加入预冷的非变性裂解液NETN(20mMpH8.0Tris HCl,100mMNaCl,1 mMEDTA,0.5% Nonidet P-40)吹打混匀，冰上静置10-15min。注意NETN用时要现加蛋白酶抑制剂，通常是Leupeptin和Aprotinin这两种(终浓度为1ug/ml)

③　12000 x 5-10min, 4°C离心

④　将离心后的上清液转移至新的EP管内，每管转移的量保持一致，注意不要吸到底部沉淀，全程冰上操作

二、免疫共沉淀

①　留取20ul左右细胞裂解的上清液加2 x loading buffer煮5min，作为input组

②　提前将琼脂糖凝珠(S beads)均分至新的EP管内，要使用剪去了尖头的枪头吸取beads，且保证每管里的beads量一致，小心吸去上清液，加入A蛋白的抗体和细胞裂解后的上清液。1mg蛋白裂解液加入25ul悬浮液包括 1:1的 S beads与2ug A蛋白抗体

③　4°C摇床孵化2-4h(期间可以配制SDS-PAGE胶，准备下一步Western blotting)

④　Binding结束，1400r x 1min, 4°C离心

⑤　真空泵或移液枪吸去上清，注意不要吸到沉淀，加入800ul NETN，上下颠倒混匀，保证底部的沉淀悬浮起来

⑥　离心，重复4)5)，洗beads三次

⑦　最后一次弃去上清，用点样枪头将残液吸净，加15ul 2xloading buffer煮5min，作为Co-IP组点样，剩下的沉淀再次加入10ul 2 x loading buffer煮一次，作为IP组点样。

三、Western blotting检测

①　点样顺序通常按照Co-IP组、Input1、Marker、IP组、Input2，跑胶。

②　转膜，封闭后Co-IP组、Input1加入蛋白B的抗体，IP组、Input2加入蛋白A的抗体4°C进行孵育。

③　回收一抗，室温孵二抗。

④　显影，观察实验结果。