一些实验前的说明
sgRNA验证:在实验开始前,可以通过sgRNA在线验证,筛选高效率的sgRNA用于敲除细胞系的构建。
基因拷贝数:建议在开始实验之前确定目标基因的拷贝数。许多永生化细胞系,尤其是癌细胞系,不是二倍体,因此可以具有3个或更多的染色体副本。
质粒的质量:使用高质量的无内毒素质粒DNA至关重要。通过读取260 nm处的吸光度确定DNA浓度。通过使用260 nm / 280 nm的比例(该比例应在1.8到2.0的范围内)来测量DNA纯度。通过琼脂糖凝胶电泳检查质粒的完整性。
细胞状况:使用维护良好并经过常规认证的高质量细胞,包括检测细菌,真菌或支原体污染。如果细胞来自新复苏的细胞,则在使用前至少完成2次传代。
图1. CRISPR基因敲除细胞系实验步骤概况。
实验步骤
sgRNA和genotype primers的设计合成
sgRNA设计:对靶基因序列进行分析,筛选合适的靶位点,每个靶位点设计1条sgRNA。通常,将Cas9靶向编码功能蛋白结构域外显子的sgRNA比单纯靶向5'外显子更有可能消除基因功能。
图2. sgRNA设计示意图。
PCR引物设计:根据靶位点设计PCR引物,用于后续靶位点DNA突变检测。
载体构建
根据设计的 sgRNA 序列,合成 Oligo DNA。酶切带有 Cas9 基因的空载体(带有荧光标签(GFP)和筛选基因(嘌呤霉素))得到线性化质粒,混合 Oligo DNA与线性化空载体,以T4 连接酶连接,添加 buffer 与 ddH2O,16℃连接过夜。
质粒验证
将连接产物转入DH5α大肠杆菌,37℃培养过夜。挑选单菌落进行扩增,提取质粒,进行酶切鉴定。
对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳,挑选具有正确大小的酶切产物进行测序验证。
质粒提取与质量检测
将验证的质粒转入新的DH5a感受态大肠杆菌中,37℃培养过夜。挑取单菌落进行扩增培养,提取质粒。检测内毒素;进行其吸光度检测(260 nm / 280 nm的比例在1.8~2.0);并通过琼脂糖电泳检测质粒的完整性。
转染前
转染前1天,将生长状态良好的293T细胞铺在6孔板中,每个孔的细胞约1.0 x 105 -3.0 x 105个。细胞培养箱中培养过夜,至90%~95%的细胞密度。
转染
将转染所需试剂在37℃水浴锅中预热(包括Opti-MEM、质粒)。
按照下图进行细胞转染。
图3. 细胞转染示意图。
单克隆筛选及鉴定
转染24 h后,即可有少部分质粒表达,在倒置荧光显微镜下可观察到绿色荧光。
转染24 h后,在培养皿中加入终浓度为2~3 ug的嘌呤霉素进行筛选,一般筛选2~3天。
用预热的PBS洗去漂浮的死细胞及血清后,加入200 ul 1◊胰蛋白酶进行消化。
加入2 ml 10%血清的培养基终止消化,然后转移到无菌的15 mL离心管中。
将细胞以800 x g离心3 min。
将细胞沉淀重悬于5 mL10%血清的培养基中。
计算血细胞计数器中活细胞的数量,以确定细胞密度。使用锥虫蓝排除死细胞,死细胞会吸收染料并变成蓝色。
在50 mL无菌离心管中,在40 mL完全生长培养基中将细胞稀释至〜1-2细胞/ 200 ul的密度。从起始悬浮液中进行10倍系列稀释,以达到此细胞密度。
将稀释后的细胞铺到96孔板中。为了保证能获得敲除细胞,6孔板一个孔对应至少2个96孔板。
3~5天后,在光学显微镜下观察96孔板,对其中含有单细胞的孔进行标记。
等到孔中的细胞密度达到70%~90%,用20 ul的1◊胰蛋白酶进行消化。
加入200 ul 10%血清的培养基终止消化。吸取100 ul的细胞悬浮液,转移至1.5 ml EP管中。剩余的细胞悬浮液留在96孔板中继续培养。
使用CRISPR/Cas9 genotyping试剂盒处理收集的细胞,用之前设计的PCR引物进行扩增,并将扩增产物进行测序。
根据测序结果,筛选具有有效突变的单克隆。
单克隆细胞的扩增
待阳性克隆细胞汇合度达到 70%以上时,依次转至 48 孔板,24 孔板,12 孔板,6 孔板中扩大培养。
记录单克隆细胞的生长情况,评估细胞系的稳定性。
用目的基因对应蛋白的单抗检测细胞的表达产物,裂解细胞,提取细胞的总蛋白,SDS-PAGE 电泳后转印到 PVDF膜上,封闭液封闭 1h 后,用一抗二抗先后孵育,化学发光成像仪下拍照分析。
图4. 单克隆敲除验证。
支原体检测及细胞冻存
用支原体检测的试剂盒检测细胞培养的上清液,PCR 鉴定,检查细胞是否遭到支原体污染。
将扩增后的稳定敲除细胞进行冻存。
参考文献:
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Christopher J. et al. Generating single cell-derived knockout clones in mammalian cells with CRISPR/Cas9. PeerJ Preprints. 2019; 7:e27511v1
Hiroshi Yamaguchi. Construction of Viral Vectors for Cell Type-specific CRISPR Gene Editing in the Adult Mouse Brain. Bio-protocol. 2019; 9(16).
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